【First-in-class药设系列】靶向蛋白复合物的药物研发进展

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCR）和配体门控离子通道（ligand-gated ion channels, LGIC）作为重要的药物靶点，是目前已批准的药物中40%药物的作用位点，在细胞膜上被胞外配体结合后会启动胞内的信号级联反应。针对这些受体进行传统的药物开发思路是通过直接靶向这些受体蛋白来促进或阻止受体的激活。近年来，研究者发现细胞中受体蛋白可以存在不同的下游通路，是通过受体与不同关联蛋白形成复合物介导的，它们的功能特点、信号通路以及定位与单独存在的受体都不尽相同。因此，对受体复合物进行靶向药物开发使得调控特定下游细胞信号通路成为可能，同时，由于受体关联蛋白往往存在组织或细胞差异性表达，靶向受体复合物也提供了更精准和更小副作用的疾病调控方式。

    由于受体复合物往往通过蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）形成的，靶向PPI仍有很大的药物发现的挑战：第一，PPI经常由大的相互作用表面形成，没有明确的可以容纳小分子的结合口袋；第二，PPI没有酶和受体那样的内源性配体，无法进行合理设计；第三，受体复合物的PPI经常是在细胞膜中或是细胞内，调控这些PPI的药物要能跨膜甚至跨过血脑屏障。

一、受体复合物的组成

受体复合物往往是由一个核心受体蛋白或一套受体亚单位蛋白和一个或更多的受体关联蛋白组成。复合物中，作为辅助的受体关联蛋白与受体蛋白直接且稳定地互作，调控受体蛋白的功能与定位。现在已经发现了很多受体复合物，如抑制性甘氨酸受体与支架蛋白桥尾蛋白等。

二、靶向受体复合物的策略

早期研究中靶向受体复合物的药物发现都是依赖于表型筛选以及高通量筛选（high-throughput screening, HTS）。但是随着冷冻电镜等技术的发展，越来越多的受体复合物结构逐渐被解析出来，有利于通过合理药物设计和基于结构的药物设计使得受体复合物的药物研发走向理性化。

    尽管受体复合物PPI在大而平坦的互作界面上难以找到具有成药特性的位点，化合物可以通过诸如结合PPI中的互作蛋白，通过变构调控改变PPI结构等策略来调控PPI。具体到某一个PPI，则需要考虑PPI的特性，尤其是与细胞膜的相对位置。例如，抗体类制剂虽能有效并特异性地结合大的表面，但由于其不易跨膜，因此主要应用于外周组织的细胞外PPI；小分子化合物能进入细胞，因此能靶向各种位置的受体复合物PPI，但由于其只占很小的面积，造成很难找到能有效改变PPI的小分子；多肽虽然透膜性一般，但是也可以调控胞内外的PPI。那么三种类型的受体复合物PPI调节剂具体要如何发现呢？以下将分类具体介绍。

1. 抗体类
抗体的主要优点是：高亲和力，高选择性，作用时间长且一般损耗率低，例如最近上市的靶向降钙素受体样受体（CALCRL）和受体活性修饰蛋白1（ RAMP1）受体复合物的埃仑单抗（erenumab），用于治疗偏头痛。随着结合杂交瘤技术、抗体噬菌体展示技术和高通量筛选等技术的发展，单克隆抗体近几年大量增多，但是对膜蛋白复合物来说，要得到合适的抗原用于抗体噬菌体展示还是具有一定挑战性。

2. 小分子类

小分子类调节剂主要通过高通量筛选结构多样化合物库中得到。在针对LGIC和GPCR等体系的筛选中，通常使用基于细胞功能的方法而不是简单的基于结合的方法，且这些方法获得的小分子还需要在蛋白水平得到验证。除了常规小分子库外，还可以用小分子片段先进行筛选，之后在此基础上进一步通过药物化学的方法优化；另外，也有人使用比一般HTS（10^6）化合物数量更大的DNA编码化合物库DEL（10^9）进行筛选，其化合物是通过测序结合在化合物上的DNA来确认化合物。

3. 多肽调节剂

当需要阻断受体复合物中两个蛋白的直接结合界面时，小分子往往不再适合，多肽可以作为优秀的切入点，后续优化主要注意解决多肽药代动力学差的缺点。多肽抑制剂发现根据复合物结构是否已知可分为两种方法：（1）如果知道PPI的结构信息时，多肽抑制剂往往来源于互作蛋白自身或者模仿互作蛋白的一个α螺旋、β片层或者β转角，其中α螺旋是用的最多的，在此基础上，常常会使用化学大环化的方法来改善亲和力、代谢稳定性以及细胞透膜性。（2）如果不知道复合物结构信息，可以使用多肽微阵列技术（如SPOT）找到多肽结合的基础序列以供进一步优化。这种方法还结合突变扫描技术进行构效关系研究。另外，多肽展示技术、核糖体展示或mRNA展示也能发现并优化多肽抑制剂。多肽调节剂的主要缺点是细胞透膜性差，不过大环化和细胞穿膜肽如TAT的引入可以帮助解决这一挑战。由于穿膜肽的引入也可能会造成一些副作用，因此在多肽调节剂的药物研发中改进穿膜肽也是一个研究热点。

三、靶向LGIC复合物的药物研发

LGIC又被称为亲离子受体，是一个已经研究了数十年的药物靶点。大多数调节剂都是直接靶向受体蛋白，分别通过占据正构位点、结合离子通道区和变构位点区几种模式发挥作用。目前，还没有靶向LGIC受体复合物的化合物被批准上市，以下是几个靶向LGIC受体复合物的实例。

1. NMDAR–PSD95

N-甲基-d-天冬氨酸受体（NMDAR）是神经药理学领域一个已经研究数十年的靶标。已发现的离子通道直接抑制剂可以在突触可塑性和脑兴奋性毒性发挥作用，应用于治疗老年痴呆、难治性抑郁等疾病。但由于抑制剂存在广泛调控多条通路的问题，一直难以在效力和副作用之间做到一个很好的平衡。

    PSD95作为突触后蛋白网络的核心支架蛋白，可与NMDAR、神经元氧化氮合成酶(nNOS)相互结合，将它们拉近形成复合物。已有研究发现兴奋性毒性情况下，大量钙离子通过NMDAR内流会过度激活nNOS从而导致NO达毒性水平，因而靶向这一三元复合物可用于治疗缺血性中风。从结构上看，该复合物中PSD95的PDZ结构域起到形成与稳定复合物的作用，作用于该结构域可以成为调控该复合物的一种方式。当前，已有靶向PSD95介导的相互作用的小分子抑制剂如IC87201和它的同系物ZL006，但亲和力只有低到中等水平。

    多肽抑制剂的亲和力就要强很多，如nerinetide（NA-1），它是一条由NMDAR GluN2B亚单位的C端9个残基和核转运激活蛋白衍生的穿膜肽TAT组成的融合肽，可以结合PSD95的PDZ-1或PDZ-2结构域，从而抑制nNOS的NO的产生。在接受血管内脑动脉瘤修复手术患者的临床II期研究中，NA-1显著降低了梗死的数目，但没有减小梗塞的大小。另外，NA-1还在进行降低重大急性缺血性卒中患者整体残疾的III期临床试验及治疗急性大脑贫血病人的临床III期研究。在此基础上，两个由GluN2B衍生的五聚体肽IETAV与聚乙二醇交联，可以同时与PDZ-1和PDZ-2结构域互作，得到了亲和力达10nM的PSD95抑制剂，比单聚体肽活性增加145倍，引入Tat肽得到的AVLX-144多肽亲和力达4.6nM，这个多肽已于2020年进入临床I期研究。

2. AMPAR-TARP

α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic acid receptor , AMPAR)负责快速兴奋传递和突触可塑性，与信息处理、学习和记忆等有关，且与一系列神经和精神性疾病如癫痫、焦虑、压力、疼痛、抑郁等有关，成为引人注目的药物靶标。由于调控门控、运输和辅助蛋白等调控，会造成原位和异源的AMPAR存在功能差异。TARP是其中研究最多的辅助蛋白。TARP家族各亚型在脑部差异性表达，其中TARPγ2主要在小脑，TARPγ8主要在海马体（与癫痫活性相关）。Eli Lilly 和Janssen Pharmaceuticals先后针对TARP γ8特异的AMPAR抑制剂展开研究，期望发现药物治疗颞叶癫痫和焦虑症而不产生共济失调。它们通过HTS及后续优化找到JNJ-55511118/JNJ-56022486以及LY3130481，但其结合位点及分子机制仍有待研究，得到它们的异源四聚体结构对之后阐明其抑制机制将十分重要。

3. AMPAR–PICK1

PICK1是一种脑中大量表达的蛋白激酶Cα结合蛋白，含一个BAR结构域和一个氨基端的PDZ结构域，与AMPAR和多巴胺转运蛋白DAT互作，其复合物与慢性疼痛有关。早期，科研人员曾通过HTS包括44,000个小分子库得到其小分子抑制剂FSC231，作用于PDZ结构域；进一步，Biogen公司在一个更大的化合物库筛选得到BIO922作用全长PICK1，其同系物共结晶显示该系列化合物作用于PDZ羧基结合loop区。此外，PICK1 PDZ结构域的多肽抑制剂与PSD95一样是基于AMPAR的GluA2和GluA3亚单位的C端，能抑制长期抑郁，减少可卡因行为的恢复。另外还有一个二聚化的抑制剂Tat–P4 -(C5) 2与前者相比同样拥有与PICK1更高的亲和力。

四、靶向GPCR复合物的药物研发

针对GPCR受体的胞外区和跨膜区，曾开发了多个小分子和多肽药物。随着对GPCR下游偏好信号理解的深入，使得发展精细调控GPCR某一偏好信号通路得以可能。以下是一些靶向GPCR受体关联蛋白的成功例子。

1. CALCRL–RAMP1

调节降钙素基因相关肽(CGRP)受体复合物，是靶向GPCR复合物的一个著名的例子，发展药物用于治疗偏头痛。CGRP受体复合体的核心成分是CALCRL（一种参与激素稳态的B类GPCR）。为了形成一个有功能的受体，CALCRL必须与RAMP1结合，RAMP1将CALCRL转运到细胞表面并保持结合。最近的冷冻电镜结构中发现，RAMP1稳定CALCRL，并与CGRP有较少的直接相互作用。

    当前已上市4个治疗偏头痛的抗体，其中Erenumab是FDA批准的第一个靶向GPCR的抗体，由安进公司开发，靶向CGRP受体复合物的配体结合位点的单克隆抗体，用于预防偏头痛。它能有效地阻止CGRP的结合，从而激活受体，亲和力和特异性相比另外两种RAMP形成的复合物达5,000倍，并且半衰期较长，只需一月皮下注射一次。其他三个生物制药fremanezumab 、galcanezumab、和eptinezumab也是靶向CGRP的抗体，阻止CGRP结合CALCRL-RAMP1复合物。

2. GBR和KCTD蛋白

GABA是大脑中主要的抑制性神经递质，通过激活突触前和突触后来调节突触传递G蛋白偶联GABA B受体(GBRs)。GBR的关联蛋白KCTD与包括双相情感障碍和抑郁症在内的神经精神疾病之间联系密切，提示GBR-KCTD蛋白复合物是很有前途的药理靶点。最近，研究人员报道了第一代干扰GBR-KCTD相互作用的多肽，它是以GBR C-末端结构域为模板进行SPOT肽微阵列，鉴定出与KCTDs具有高亲和力的18聚体先导肽，但是现阶段只在体外有效。

五、未来与展望

当前，合理靶向受体复合物的药物研发仍处于早期，其中一个瓶颈在于筛选方法的构建，需要再三考虑与确证。随着越来越多受体的内在互作蛋白功能逐渐被发现，以及其受体复合物结构被解析，之前认为不可成药的靶标（包括LGIC和GPCR家族成员），利用合理的基于片段的药物设计找到优良的先导化合物不再遥不可及。之前大多数靶向受体复合物的形式都是通过阻止或者改变两个蛋白的相互作用的方式，将来也应该更多地尝试稳定受体复合物，或通过配体来靶向降解蛋白来进行药物研发。在对这些相关的受体复合物进行表征后，无论是膜内还是细胞内，小分子和肽都可以作为不可或缺的工具来开发治疗性相关的调节剂，从而为多种疾病提供新的候选药物。

参考文献

1. Rosenbaum, M.I., et al. Targeting receptor complexes: a new dimension in drug discovery. Nat Rev Drug Discov. doi: 10.1038/s41573-020-0086-4  (2020).

2. Santos, R. et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16, 19–34 (2017).

3. Huttlin, E. L. et al. Architecture of the human interactome defines protein communities and disease networks. Nature 545, 505–509 (2017)

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