【First-in-class药设系列】抗痉挛及肌肉僵直的药物设计与研发

肌肉痉挛（spasticity）是上运动神经元损伤后脊髓反射活动增多所引起的以骨骼肌不自主的张力增强为特征的感觉运动障碍，常见于脑卒中、外伤、脑瘫和多发性硬化症等肌病患者。神经系统损伤后的肌肉痉挛和腰背痉挛疼痛使得大多数患者无法正常的生活和工作，因此给患者家庭以及社会造成了严重的负担。目前针对骨骼肌痉挛的治疗方案主要包括使用肌肉松弛剂进行药物治疗或直接进行手术治疗。市场上现有的肌肉松弛剂主要有作用于中枢神经系统的巴氯芬和替扎尼定等、作用于神经肌肉接点的肉毒毒素和琥珀酰胆碱等以及作用于肌细胞肌浆网的丹曲林等。然而，由于这些药物的靶标都是控制肌肉收缩的上游调节因子，因此容易造成神经系统及心血管等方面的副作用。此外，通过高选择性脊神经背根切断术进行手术治疗也极易导致严重的副作用，比如脊柱瘫痪、慢性背痛、感觉功能障碍和囊肿形成等。因此，亟需开发新一代的既能直接靶向肌肉收缩效应蛋白又避免神经系统及心血管系统等各项副作用的抗痉挛药物。

    肌球蛋白（myosin）是肌肉收缩过程中的重要效应蛋白，是真核细胞内的一类ATP依赖型分子马达，它具有ATP水解酶活性，能够利用水解ATP时产生的能量来促进肌肉的收缩。肌球蛋白是个超级庞大的超家族，包含了多个成员。其中存在于骨骼肌中的主要是肌球蛋白2亚型，这也是发现的最早的一类肌球蛋白。人类中的肌球蛋白2是由MyH1-16这16种基因所编码组成，广泛分布于骨骼肌、心肌、平滑肌和其他一些组织中。值得注意的是，在骨骼肌中，除了MyHC 2 X/D, 以及MyHC2A和MyHC2B这三种快速亚型具有骨骼肌特异性之外，其他亚型会与心肌等其他组织中的肌球蛋白2在序列和结构上高度相似，例如由MyH7b基因编码的慢速亚型就与心肌中的β--肌球蛋白非常类似，从而为开发高选择性作用于骨骼肌的抗痉挛药物提出了挑战。近日，匈牙利的研究人员在Cell上报道了骨骼肌和心脏肌球蛋白2型之间的位于功能区通讯中心的关键残基差异，可以使开发直接和选择性靶向治疗痉挛和肌肉僵直的药物成为可能。

    研究人员首先通过对MyHC IIa肌球蛋白的结构进行深入研究，开发并优化了一种能够嵌入Blebbistatin结合口袋的小分子抑制剂—MPH-220（图A）。实验表明，MPH-220能够特异性的抑制来自兔子叉腰肌上的快速型骨骼肌肌球蛋白2，而对包括猪心肌和平滑肌在内的其他组织上的肌球蛋白2均没有影响（图E，F）。通过对MPH-220的结合位点进行序列分析研究人员发现，快速型骨骼肌肌球蛋白2和其他组织中的肌球蛋白2各亚型在MPH-220结合位点附近存在一个氨基酸差异：在快速型骨骼肌肌球蛋白2中，该位点上是一个亮氨酸，而在其他组织的肌球蛋白2各亚型中，该位点全部是苯丙氨酸（图B）。研究人员推测，这可能是引起MPH-200具备高特异性的一个主要的原因。为了验证这个假设，研究人员将非肌肉型肌球蛋白2C亚型中对应位置上的丙苯氨酸突变成了亮氨酸，结果发现，在突变之前，MPH-220对非肌肉型肌球蛋白2C亚型没有任何作用，而突变之后，可以观察到明显的抑制效果，从而进一步证实了研究人员的假设（图E）。考虑到MPH-220对肌球蛋白样品的选择性并评估其成为新一代抗痉挛药物候选药物的潜力，接下来，研究人员在人源性的肌球蛋白样品上进行了ATP酶活性抑制实验。结果显示，MPH-220对于表达纯化得到的β-心肌肌球蛋白2没有任何抑制作用（图G）。研究人员随后进一步用病人来源的活检样品进行了实验，得到了类似的结果。此外，通过两份含有不同比例快速型骨骼肌肌球蛋白2的肌肉组织进行分析研究人员发现，MPH-220对它们的抑制作用也只是部分的，这说明MPH-220确实只能选择性抑制快速型肌球蛋白2（图H）。这些实验结果为将来MPH-220能够安全系统地用于人类患者提供了实验基础。

    为进一步研究MPH-220高选择性抑制快速型骨骼肌肌球蛋白2的分子机制，研究人员通过共结晶获得了MPH-220与快速型骨骼肌肌球蛋白2b相结合的结构，并进一步确认了结构中MPH-220的结合位点靠近第476位点的亮氨酸（图A）。然后，将该结构与结合有Blebbistatin 的肌球蛋白2的结构进行比较发现，这两个抑制剂的核心区域定位都非常相似，并且它们的手性羟基都是与G248和L270相互作用的（图B），然而心肌肌球蛋白2中与快速型骨骼肌肌球蛋白2第476位亮氨酸对应的丙苯氨酸给MPH220带来了空间上的位阻（图C）。这一发现正好为之前的实验结果提供了合理的解释，并说明L476确实是MPH220发挥高选择性抑制作用的关键结构基础。

    接下来，研究人员深入研究了通过口服和腹腔静脉注射MPH-220对活体动物肌力生成的影响（图A）。通过分析，研究人员发现，在MPH220的所有对应异构体中，MPH-220的S（-）构型的力松弛效果是最好的（图C）。此外，MPH-220在活体动物中的作用是呈剂量依赖型的，且有效时间能持续10个小时之久（图B, C）。口服给药时，MPH-220的药效也只比腹腔内注射慢一点点，由此说明了MPH-220具有吸收性好、高渗透性等优点，这些指标均说明MPH-220作为一种潜在的药物具有比较好的药理特性。通过对用药后兔子的心率、血流速度和呼吸频率等指标进行监测研究人员发现，在不同剂量下，MPH220对心血管系统以及呼吸系统均没有太大的影响，并且在长达10小时的监测中，除了后续由于麻醉兔子长时间未进食导致的心率略微波动之外，其余均无异常指标（图D, E, F）。这些指标再次证实了MPH-220在体内的安全性。另外，研究人员还观测了MPH-220在大鼠不同组织中的蓄积性。实验结果显示，MPH-220在肌肉中的累积量也是剂量依赖型的。随着时间的推移，当MPH-220完全从血液和其他组织中消除时，骨骼肌中的积累在3h后持续存在，而其在靶肌中的浓度仍在有效浓度范围内（图G, H,Ｉ），从而说明了抑制剂MPH-220与快速型肌球蛋白的高结合亲和力和特异性。

    为探索MPH-220对脑损伤后的步态障碍的治疗效果，研究人员利用了最近开发的痉挛性脑瘫动物模型来进行深入的研究（图A）。他们让有痉挛症状的大鼠在一个长80cm宽80cm的塑料盒子里运动15分钟，盒子底下是一块8mm厚的透明有机玻璃，下面装有步态感应器，能够记录小鼠的运动步态（图B）。研究人员分别分析了MPH-220的治疗对每只动物的影响。大鼠A由于痉挛无法正常使用它的右前肢和左后肢，因此它只能沿着右边单方向转圈，然而在MPH-220给药40分钟之后，可以明显看到这只大鼠的后肢步态有了明显的改善，左转弯比例也在逐渐增加，治疗3小时后能提高到51％（图C）。大鼠C的症状在于它无法用两侧后肢，右后肢会不时的倒地或者抽搐。研究人员通过给大鼠C进行MPH-220进行给药治疗后发现，这只大鼠在给药后3小时及5小时时发生倒地和抽搐的频率均有明显的下降，而左右脚着地的次数也逐渐增加（图D），从而证明了MPH-220对该类步态障碍的治疗效果。大鼠D的情况是无法使用右后腿，这使得它的四肢爪子无法在地面上正常定位。研究人员通过描绘该小鼠在进行MPH-220给药治疗后的步态发现，与健康组相比，该小鼠在给药5小时后，可以开始正常使用两只后肢了，步态也逐渐趋于正常状态了（图E, F）。这几个实例说明，MPH-220确实在改善脑损伤导致的步态障碍方面具有明显的效果。

    最后，研究人员通过基于神经网络的深度学习以及主成分分析来重点研究了治疗引起的痉挛相关步态成分的变化。对于所有动物在开放场试验中自由运动15分钟期间的地面运动，研究人员使用了28个参数来表征动物四肢和身体轴在三个运动速度状态下的三维位置, 然后根据姿态估计深度学习算法来量化运动特征，并将这些特征暴露在主成分分析(PCA)中。PCA中包含三个主要的成分PC1,PC2和PC3，其中PC1与健康范围有显著性差异，这表明锥体束损伤引起的痉挛性行走不对称反映在了主要步态成分里（图A）。最重要的是，MPH-220治疗显著降低PC1评分，这证实MPH-220改善了治疗动物的步态模式，使其与健康大鼠的步态模式一致（图A）。当研究人员分别分析这三种速度状态时，他们发现在慢速和中速状态下，椎体束损伤主要影响PC1，而在快速状态下则主要影响的是PC2和PC3。经过MPH-220治疗后，慢中速状态下的PC1以及快速状态下的PC3评分均有了明显的改善，逐渐趋于正常范围（图B）。接下来，研究人员识别了能够在慢速、中速和快速状态能够对PC1和PC3具有显著影响的主要参数。分析表明，在低速和中速状态下，MPH-220给药后对代表大鼠爪位置的椭球体的体积和它们的中心之间的距离的影响最大。另一方面，在快速状态下，MPH-220对椭球角的影响最明显，这表明治疗后的大鼠可以保持腿靠近身体轴，类似于健康的跑步模式（图C，D, E）。这些结果进一步证实了MPH-220能够治疗脑损伤后运动异常的痉挛成分，显示出一种很有前途的潜力来有效的解决抗痉挛治疗中未满足的医学需求。

    总的来说，本研究各项数据均显示，小分子抑制剂MPH-220能够特异性作用于快速型骨骼肌肌球蛋白2亚型，具有良好的药理特性，并且不会对神经系统以及心血管系统等造成副作用，有望成为能提高肌痉挛和肌僵硬等患者生活质量的一种安全性高、有潜力的新一代抗痉挛药物。

参考文献

Gyimesi M, Horváth ÁI, Túrós D, Suthar SK, Pénzes M, Kurdi C, Canon L, Kikuti C, Ruppel KM, Trivedi DV, Spudich JA, Lőrincz I, Rauscher AÁ, Kovács M, Pál E, Komoly S, Houdusse A, Málnási-Csizmadia A. Single Residue Variation in Skeletal Muscle Myosin Enables Direct and Selective Drug Targeting for Spasticity and Muscle Stiffness. Cell. 2020, 183(2):335-346.e13.

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