【变构原创系列】GPCR-脂膜界面的变构位点药物发现进展
G蛋白偶联受体作为膜受体超家族，在生理过程中发挥着重要作用，包括细胞增殖、代谢和神经调节。GPCRs是治疗性药物的重要靶点，变构调控GPCR是药物发现的新方向。传统的GPCR靶向药物主要结合受体上高度保守的正构位点，虽然一些药物已经取得了一些成功的应用，然而，正构药物靶点的高度保守性导致了药物应用过程中副反应的发生。变构调节剂(也称为变构配体)与正构配体相比，可以通过靶向受体中保守度较低的变构位点来减少副作用。
由于近年来结构生物学的重大突破， GPCR的细胞外、细胞内或7个跨膜螺旋核心区域内上的变构位点被陆续报道。然而，传统的GPCR变构位点在同源亚型之间也存在一定的保守性，使得GPCR变构调节剂的应用也成为一个难题。解决这一问题的一个有前途的方法是设计针对受体表面位置的变构调节剂。但是位于细胞外侧的表面变构位点通常是平坦的，使得设计非常困难。有趣的是，近年来一类独特的变构位点—受体-脂质双分子层界面(Lipid-Facing)变构结合位点不断被发现，这类变构位点与传统的变构位点有很大的不同，比传统的变构位点更依赖于脂质双分子层。迄今为止，这类位点是GPCRs所特有的，在特定的受体上呈现出多样性，是克服GPCR药物发现难题的一种很有潜力的策略。
这里我们总结了近年来这种新型变构位点的研究进展。目前为止，只在 A类和B类GPCRs中发现了这种新的变构位点（其中包括6个A类和2个B类），靶向该位点的小分子共13种。我们重点关注了小分子调节剂与脂质双分子层之间的相互作用，边界面积以启发针对这类变构位点的变构配体的开发。
一、A类GPCRs的Lipid-Facing变构结合位点
GPCR | Allosteric modulator | PDB | Resolution (Å) | Allosteric site |
Class A | ||||
GPR40 | TAK-875 | 4PHU | 2.33 | outside 7TMD (III-V), extracellular side |
GPR40 | AP8 | 5TZY | 3.22 | outside 7TMD (II-V), intracellular side |
GPR40 | MK-866 | 5TZR | 2.2 | outside 7TMD (III-V), extracellular side |
β2AR | Cmpd6FA | 6N48 | 3.2 | outside 7TMD (II-IV), intracellular side |
CB1 | ORG27569 | 6KQI | 3.245 | outside 7TMD (II-IV), intracellular side |
P2Y1R | BPTU | 4XNV | 2.3 | outside 7TMD (I-III), intracellular side |
PAR2 | AZ3451 | 5NDZ | 3.6 | outside 7TMD (II-IV), extracellular side |
C5aR | NDT9513727 | 5O9H | 2.7 | outside 7TMD (III-V), intracellular side |
C5aR | avacopan | 6C1R | 2.2 | outside 7TMD (III-V), intracellular side |
Class B | ||||
GCGR | MK-0893 | 5EE7 | 2.5 | outside 7TMD (VI-VII), intracellular side |
GCGR | NNC0640 | 5XF1 | 3.19 | outside 7TMD (VI-IV), intracellular side |
GLP-1R | PF-06372222 | 5VEW | 2.7 | outside 7TMD (V-VII), intracellular side |
GLP-1R | NNC0640 | 5VEX | 3.0 | outside 7TMD (V-VII), intracellular side |
1. GPR40-TAK-875, GPR40-AP8, GPR40-MK866
GPR40在代谢稳态中发挥关键作用，可被游离脂肪酸(中链和长链)激活。GPR40在胰腺细胞中高表达，GPR40激动剂是2型糖尿病(T2DM) 治疗中的一个重要手段。在GPR40的受体-脂质双分子层的界面上共发现了两个Lipid-facing变构位点。其靶向小分子分别是局部激动剂TAK-875，全激动剂Ago-PAM。我们使用PISA web server计算了TAK-875的受体埋藏面积和暴露于脂质双分子层的表面积。结果表明，TAK-875暴露于脂质双分子层的表面积为286.97Ų，占配体总溶剂可及表面积(SASA)的35.1%。受体埋藏面积为531.74 Ų (占比64.9%)，暴露面积与埋藏面积之比为0.5936。AP8暴露于脂质双分子层的表面积为177.92 A²，占总总面积的22.6%。受体埋藏表面积为610.74 A² (77.4%)，暴露面积与埋藏面积之比为0.2913。值得注意的是，AP8的比例小于TAK-875，可能是由于两种配体的结合模式不同的原因。而与TAK-875变构位点相似的MK866暴露于脂质双分子层和被受体埋藏的表面积分别为285.01 A²和531.58 A²，分别占总SASA的34.9%和65.1%。暴露面积与埋藏面积之比为0.5362，也类似于TAK875。
2. β2AR‒Cmpd-6FA
β2-肾上腺素能受体（β2AR）是典型的A类GPCR，在血管和支气管平滑肌中广泛表达。β2AR被内源性激动剂如肾上腺素激活后介导心血管功能和肺部生理过程，是治疗血管和呼吸系统疾病的重要靶标。此外，它对于克服免疫抑制和提高免疫疗法的疗效也至关重要。最近，已经确定了一种名为Cmpd-6FA（Cmpd-6的衍生物）的β2AR正调节剂。该配体结合的变构位点位于受体-脂质双层的界面。受体埋藏的表面积为430.71 A²，占总表面积的49.7%，而配体的总表面积的50.3%部分 (436.73 A²)暴露在脂质双层。
3. P2Y1R-BPTU
P2Y1受体（P2Y1R）是人嘌呤能GPCR的一个亚家族，在血栓形成中起调节作用，并诱导血小板聚集。此外，它还介导Ca2+波传播，神经元的轴突初始节（AIS）和炎症反应等生理过程，被认为是多种疾病的有希望的药物靶标。一种新型拮抗剂1-（2-（2-（叔丁基）苯氧基）-吡啶-3-基）-3-（4-（三氟甲氧基）苯基）尿素（BPTU）已开发用于血栓形成的治疗。有趣的是，BPTU还显示了独特的配体与受体-脂质双层界面处的变构位点结合模型。BPTU暴露于脂质双分子层的表面积为265.48 A²，占总表面积的39.3%。而受体埋藏表面积(409.88 A²)占总表面积的60.5%，暴露面积与埋藏面积之比为0.6477。
4. PAR2-AZ3451
蛋白酶激活受体2（PAR2）是是一种自激活受体。PAR2在许多人类细胞（如上皮细胞，炎性细胞和神经细胞）中高度表达，与多种疾病有关，包括代谢性疾病，炎症和神经变性。在过去的几年中，通过激动剂和拮抗剂来调节PAR2功能被认为是用于调节特定疾病的有前途的治疗策略。激动配体AZ3451的受体埋藏面积为460.86 A²，占总表面积的59.2%。配体的其余部分扩展到脂质双分子层占总表面积的40.8% (317.74 A²)，暴露面积与埋藏面积之比为0.6895。
5. CB1 Receptor-ORG27569
人大麻素受体1（CB1受体）在大脑中表达最高，其介导大麻素引起的中枢神经系统活性。CB1受体在睡眠，记忆和疼痛感方面发挥重要作用。迄今为止，报道了多种天然和合成大麻素以及CB1受体的变构调节剂，用于治疗多种人类疾病，例如癫痫病。最近，CB1受体及其变构调节剂ORG27569的共晶体结构已被解析（PDB ID：6KQI）。ORG27569暴露于脂质双分子层的表面积为303.33 A²，占配体总表面积的46.2%，受体埋藏的表面积为353.40 A²，占表面积的53.8%，暴露面积与埋藏面积之比为0.8583，表明脂质双分子层对变构位点的重要性。
6. C5aR-NDT9513727和C5aR-Avacopan
人C5a受体（C5aR），也称为CD88，在T细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞上高度表达。C5a（74个氨基酸的过敏毒素肽）与受体结合并调节许多有效炎症介质的释放。C5a / C5aR轴参与神经性疼痛事件，并且C5aR还充当嗜中性粒细胞中的促凋亡受体。研究表明，C5aR是多种炎性疾病（包括神经性和炎性疼痛，败血症和癌症）的潜在治疗靶标。近来研究指出 C5aR变构非肽拮抗剂是一种新颖的抗炎治疗方法，其有助于解决C5aR肽拮抗剂药物的难题。据报道，非肽拮抗剂C5aR-avacopan和NDT9513727的变构结合位点位于受体-脂质双层界面上。NDT9513727暴露于脂质双分子层的配体表面积占总面积的38.9%。暴露面积与埋藏面积之比为0.6380。经计算avacopan暴露于脂质双分子层的配体表面积为222.28 A²，受体埋藏的表面积为581.26 A²，比例为0.3824。
二、B类GPCRs的Lipid-Facing变构结合位点
1. GCGR‒MK-0893和GCGR‒NNC0640
G蛋白偶联胰高血糖素受体（GCGR），在多种人类细胞（例如肾脏，肝脏和胰腺细胞）中表达。GCGR的激活由内源性肽激动剂胰高血糖素触发。靶向GCGR是糖尿病的重要治疗策略，针对GCGR的小分子拮抗剂已用于治疗2型糖尿病，例如MK0893（图2）和4- [1-（4-环己基苯基）-3-（3-甲烷-磺酰基苯基） ）脲基甲基] -N-（2H-四唑-5-基）苯甲酰胺（NNC0640）。受体-配体的二元复合结构表明，MK-0893和NNC0640（PDB ID：5XF1）的变构结合位点位于受体-脂质双层的界面。经计算，MK0893被受体埋藏的配体表面积为450.21 A²，占总表面积的51.6%。配体暴露于脂质双分子层的表面积为422.14 A²，占总表面积的48.4%。暴露面积与埋藏面积之比为0.9377，表明了脂质双分子层对变构位点的贡献。NNC0640变构结合位点与MK-0893相似。暴露于脂质双分子层和被受体埋藏的配体表面积分别为403.90 A²和454.50 A²，暴露面积与埋藏面积之比为0.8887。
2. GLP-1R‒PF-06372222, GLP-1R‒NNC0640和GLP-1R‒LSN3160440
胰高血糖素样肽（GLP）-1受体（GLP-1R）被内源性GLP-1肽激活。GLP-1R广泛分布于人体组织，如肺，肾，肠，心脏，血管和大脑。GLP-1 / GLP-1R系统不仅介导胰岛素释放和葡萄糖稳态的调节，而且在心血管活动，胃排空和神经系统中起重要作用。PF-0637222和NNC0640的结合模式类似于MK0893。PF-06372222暴露于脂质双分子层的表面积为291.93 A²，占总表面积的36.7%(表S1)，受体埋藏面积为503.47 A²，占总表面积的63.3%。暴露面积与埋藏面积之比为0.5798。NNC0640暴露于脂质双分子层的表面积为354.68 A²，占总表面积的40.5%，受体埋藏面积为521.94 A²，占总表面积的59.5%。暴露面积与埋藏面积之比为0.6798。LSN3160440暴露于脂质双分子层的表面积为236.87 A²，占总表面积的39.2%，而受体埋藏面积为367.93 A²，占总表面积的60.8%。暴露面积与埋藏面积之比为0.6438。
脂质环境通过膜脂质与受体之间的相互作用调节许多GPCRs的功能，如脂质双分子层可以作为一个贮存库，在嵌入脂质双分子层的受体周围聚集小分子。这样可在小分子从溶剂转移到脂质双分子层时通过增加配体与受体的碰撞速率增加配体效应的持续时间。如“P2Y1R-BPTU-membrane”系统的分子动力学模拟研究揭示脂质双分子层可以减少小分子的构象空间，促进小分子结合姿态的预制备。另外，也有报道指出真核细胞中具有代表性的膜脂质分子—胆固醇可能在GPCR的构象动力学、配体结合和寡聚化中发挥重要的调节作用。近年来，几个被解析出来的胆固醇-GPCR的复合体结构(PDB ID 3EML, 5K2D表明胆固醇结合在GPCR的变构位点。结合位点位于脂质-双分子层界面或深层TM区域，相互作用主要由胆固醇基团和TM表面残基之间的氢键介导。
根据之前的总结，变构调节剂与受体内部结合时，配体暴露面积与埋藏面积之比大多小于0.1，说明配体表面主要被受体埋藏。相比之下, 靶向Lipid-Facing变构位点的变构配体暴露面积与埋藏面积之比大多高于0.5, 这表明脂质双分子层对受体-脂质双分子层的变构效应提供了重要贡献。而从配体设计角度来看，这些变构调节剂有两部分，一部分埋藏在跨膜螺旋下，另一部分暴露在脂质中。暴露于脂质的配体基团的面积越小其cLogP越高，这可以帮助人们在未来设计这样的调节剂来平衡蛋白质接触中的疏水性和接触到脂质双分子层的暴露部分的大小。
参考文献
1. Lu S, Zhang J. Small Molecule Allosteric Modulators of G-Protein-Coupled Receptors: Drug-Target Interactions. J Med Chem. 2019;62(1):24-45. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.7b01844
2. Ying Wang, Zhengtian Yu, Wen Xiao, Shaoyong Lu, Jian Zhang, Allosteric binding sites at the receptor–lipid bilayer interface: novel targets for GPCR drug discovery, Drug Discovery Today, 2020, ISSN 1359-6446, https://doi.org/10.1016/j.drudis.2020.12.001