【First-in-class药设系列】可透膜的高选择性Pin1共价抑制剂设计
蛋白质的磷酸化以及磷酸化后级联反应调控细胞内多种癌症相关的信号转导通路。在细胞周期调控中,丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸基序是许多关键蛋白激酶的唯一磷酸化位点，其有两种完全不同的顺/反异构体,而肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1(Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase NIMA-interacting 1)是目前发现的催化该顺/反异构体相互转变的唯一酶。这一唯一性决定了其在细胞周期调控、转录因子调节、细胞的增殖和分化调节中所发挥的不可替代的作用。Pin1与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关，其激活至少43个癌蛋白，使超过20个肿瘤抑制因子失活，并下调了总体microRNAs，是致癌信号网络的"主"磷酸化后调节器，被称为肿瘤发生发展的致癌信号。此外，研究表明Pin1对于Ras激活所诱导的肿瘤发生是必需的。因此，开发Pin1抑制剂对于治疗Ras驱动的肿瘤发生并规避Ras的难靶性具有重要意义。
然而，Pin1抑制剂的开发却颇有挑战。抑制效力的实现需要阴离子化合物与Pin1的磷酸结合口袋相互作用，而这会牺牲化合物的细胞透膜性，而当突出透膜性时则又可能使化合物丧失相应的选择性。之前报道的化合物无不受其困扰。美国哈佛医学院的研究人员近期开发出一种兼顾选择性和透膜性的Pin1共价抑制剂BJP-06-005-3，能够很好地用于研究Pin1在肿瘤发生发展中的功能和机制。
该工作是基于之前报道的Pin1非天然多肽抑制剂D-PEPTIDE，其对蛋白有高亲和力（Ki = 20 nM），但无法透膜进入细胞。研究人员基于理性的设计，用苯丙氨酸替换形成磷酸酯的苏氨酸，用乙酯代替碳端的氨基封端，将氮端的酰胺甲基化以消除氢键供体，从而改善多肽抑制剂的细胞透膜性。之后考虑用共价结合的策略弥补细胞渗透性基团替换所引起的亲和力损失。参照D-PEPTIDE的共晶结构以及之前组学层面半胱氨酸反应性的鉴定，引入α-氯乙酰胺作为亲电基团以与Pin1氮端的Cys113形成共价偶联，从而获得了兼顾高亲和力和高透膜性的分子BJP-06-005-3（Ki = 15 nM，clogP = 2.89）。
之后研究人员评估了BJP-06-005-3的有效性，共价性以及选择性。借助糜蛋白酶偶联的PPIase实验检测了BJP-06-005-3抑制Pin1酶活的能力，其表观Ki值为48 nM。借助质谱分析和结构生物学证明了BJP-06-005-3对Pin1表现出100%的共价标记且修饰位点确为Cys113。最重要的是，研究人员借助脱硫生物素（DTB）偶联探针（BJP-DTB）在共价抑制剂靶标位点识别（CITe-Id）实验中证实了BJP-06-005-3独一无二的选择性——在HEK293裂解液的整个蛋白质组标记位点中，Pin1的Cys113是唯一显示出与BJP-06-005-3呈剂量依赖性结合的半胱氨酸。
BJP-06-005-3的细胞透膜性也在活细胞竞争实验中被评估，其表现出剂量依赖性和时间依赖性地竞争BJP-DTB与Pin1的结合。
研究人员也在PDAC模型中鉴定了BJP-06-005-3介导Pin1对肿瘤细胞所发挥的功能。BJP-06-005-3可以剂量依赖性和时间依赖性地降低胰腺癌细胞系（PATU-8988T C1）的转化能力，而在Pin1敲除细胞系（PATU-8988T C2）中，无论是阿霉素（Dox）诱导的Pin1表达还是转入Pin1融合蛋白（FKBP12F36V-Pin1），也都能有效的恢复BJP-06-005-3对肿瘤细胞活力的抑制。
考虑到Pin1在细胞周期调控中的重要功能，研究人员还探究了BJP-06-005-3对细胞周期进程的影响。BJP-06-005-3能够剂量依赖性地增加有丝分裂关键因子CDK1的15位酪氨酸的磷酸化，从而对细胞周期进行适度的阻滞。此外，Pin1作为Ras驱动肿瘤发生的必须因子，进一步的探究发现Pin1抑制可以与KRAS突变降解协同发挥抗肿瘤细胞增殖的作用。
本研究在理性设计的指导下，通过对多肽抑制剂的效力，选择性和透膜性进行反复优化，得到了当前选择性最好的Pin1可透膜抑制剂BJP-06-005-3。BJP-06-005-3 可与KRASG12V降解协同发挥抗肿瘤细胞增殖的功能。更重要的是，BJP-06-005-3是一种强大的多功能工具化合物，可用于进一步探究Pin1在Ras驱动的肿瘤发生发展中的作用，从而为胰腺癌这类难以治疗的肿瘤提供新的解决思路。
参考文献
Pinch BJ, Doctor ZM, Nabet B, et al. Identification of a potent and selective covalent Pin1 inhibitor. Nat Chem Biol. 2020;16(9):979-987.