【First-in-class药设系列】靶向蛋白-蛋白互作的多肽药物研发策略
蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）在生物体内参与调节许多重要的细胞过程，如细胞增殖、分裂、凋亡、坏死及蛋白转录和翻译等。人类体内大约有130,000个PPI，其中许多与心血管疾病和癌症等重大疾病的发生发展密切相关。开辟PPI类型的靶标并研发其激动剂或抑制剂，一直是国际创新药物研发领域的前沿方向。
目前，已上市的PPI类药物主要包括周期蛋白依赖性激酶4和6 (CDK4/6)抑制剂(如palbociclib、ribociclib和abemaciclib)、检查点抑制PD-1/PD-L1抑制剂（如nivolumab和atezolizumab）和靶向HER2蛋白的曲妥珠单抗，这些药物分子主要分为抗体类和化学小分子类药物。抗体类分子由于其细胞渗透性低，对于细胞内靶标难以到达，可开发的药物范围受限。相反，小分子药物(<500 Da)因其良好的稳定性、口服生物利用度和跨膜能力而一直是细胞内靶标药物开发的首选分子类别。例如靶向PPI的小分子药物navitoclax，能进入细胞与抗凋亡蛋白BCL-2紧密结合，阻断BCL-2与促凋亡蛋白BAK/BAX的相互作用，从而促进凋亡。小分子用于PPI互作的调控虽对靶标定位比较普适，但也有其缺陷。由于PPI互作的界面表面积往往较大（约1000-3000Å^2），且PPI的作用界面较为平坦，使得小分子和蛋白难以结合，亲和力较低，成药性差。
多肽是具有生物类高亲和力和小分子类生物物理特性的一类分子，是用于研发调控PPI互作药物中的重要策略。然而，由于多肽的本身特征，将靶向PPI的多肽转化成治疗药物仍然存在多种挑战，例如：血清蛋白酶稳定性和耐药性；靶标亲和力和毒性，细胞通透性等。为了改善多肽的成药性，药物研发人员往往需要利用不同方法对其进行化学优化（如环化），将其二级结构限制为稳定和特异性的构象，以提高生物活性和特异性。
一、环化策略（Cyclization Strategy）稳定多肽
环化策略中一种常用方法是采用"侧链到侧链”的环化，称为Stapling（订书肽）。该方法是通过侧链共价键将α-螺旋相邻转角上的残基连接起来。Stapling方法中可使用的经典linker包括内酰胺、烯烃、三氮唑、硫醚和二硫键等；线肽改造成订书肽后，其结合蛋白界面所需的能量降低，亲和力增加。
环肽的另一策略是将多肽的N端和C端之间肽键进行环化(即骨架环化)，称为Molecular Grafting。当前已发现多种设计的大环肽可选择性地与涉及肥胖、癌症和HIV的靶点结合。例如，将活性序列PMI (p53的模拟物)嫁接到环肽中，可以有效抑制p53与MDM2和MDMX之间的相互作用。
二、高通量筛选获得高亲和力多肽
Phage display方法是将DNA序列插入到噬菌体，和噬菌体衣壳蛋白融合展示于噬菌体表面，进行高通量筛选及富集，以确定最有效的binders；SICLOPPS技术是利用蛋白从蛋白结构域（外蛋白）中去除自身并催化首尾肽连接的能力在细胞内生成大环肽。质粒编码随机化的肽序列，随后片段内酰胺环化。这种技术通常局限于包含20种典型氨基酸的肽段。mRNA display技术是在筛选过程中，通过mRNA与其编码的多肽或蛋白质共价结合，形成mRNA-蛋白质融合体，形成大容量的多肽筛选库 (10^13 ～10^15 )，并在其中筛选到可以结合特定靶标的多肽。OBOC技术是利用磁珠通过化学方法顺序合成D-氨基酸（或带有修饰侧链的氨基酸）砌块，继而通过各种化学策略进行环化并从磁珠上剪切下来建立筛选库，利用结合在另一套磁珠上的靶蛋白从筛选库中分离出有效的多肽。
三、穿膜肽提高多肽先导物的细胞通透性
细胞穿膜肽（Cell-Penetrating Peptides, CPPs）已广泛用于携带大蛋白和其他亲水性分子进入细胞。CPPs进入细胞的机制目前可分为两种:依赖ATP的内吞途径和不依赖ATP的膜易位途径。大多数CPPs是带正电荷的，它们与细胞膜的相互作用是通过静电与磷脂头基和与细胞表面的糖胺聚糖(GAGs)相互作用完成的。当前穿膜肽中应用最广的是来自HIV-1转录反式激活因子(Trans-activator of transcription, Tat)。Tat是一条由12个氨基酸组成的带正电荷的短肽(GRKKRRQRRRPQ)，负责将多肽药物携带并传递到细胞中。
虽然已发现几千条具有穿膜效果的CPPs，但目前仅有少数CPP偶联药物被用于临床。为了提高穿膜肽的穿模效率且改善了其内化的动力学，Hackenberger和Cardoso组将穿膜肽环化，使用环肽R10 (cR10)将纳米体(即相对于正常免疫球蛋白而言，相对较小且稳定性和溶解性良好的单链抗体片段)递送到细胞胞浆中。另外，通过破坏包裹CPP内吞小泡的膜来释放高含量的肽或者同时提高直接膜转位的能力，都是优化CPP偶联药物进入细胞内靶点的可行策略。
综上，多肽基于其内在优势，正逐渐发展为一种有前景的PPI靶标药物研发方法。为了更好的进行多肽药物研发，各种生物高通量筛选技术和新型化学修饰方法的建立有效增强了多肽对蛋白酶的抗性，并有利于将多肽转化为药物先导分子。除此之外，有关CPPs摄取机制的研究也为开发靶向细胞内PPIs的多肽提供更多思路。
参考文献
1. Basanta, B. et al. An enumerative algorithm for de novo design of proteins with diverse pocket structures. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 22135–22145
2. Philippe, Grégoire JB, David J. Craik, and Sónia T. Henriques. "Converting peptides into drugs targeting intracellular protein–protein interactions." Drug Discov Today. 2021, doi: 10.1016/j.drudis.2021.01.022
3. Fosgerau, K. and Hoffmann, T. Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discov. Today 2015, 20, 122–128
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