【First-in-class药设系列】靶向GPR20的抗胃肠道间质瘤抗体-药物偶联物设计
胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor, GIST)是胃肠道最常见的间充质肿瘤，源于Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal, ICC)癌变。大多数成年人胃肠道间质瘤是由KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(KIT)或血小板衍生生长因子受体α(PDGFRA)的激活突变所驱动。然而，大约10%到15%的成人和85%的儿童胃肠道间质瘤中没有KIT/PDGFRA突变，统称为KIT/PDGFRA WT GIST。他们通常含有BRAF、RAS、NF1和琥珀酸脱氢酶复合物的不同基因改变，琥珀酸脱氢酶缺陷型GIST是这其中的常见类型。
目前，已批准的胃肠道间质瘤的治疗方法都是酪氨酸激酶抑制剂，如伊马替尼（Imatinib）、舒尼替尼（Sunitinib）、雷戈非尼（Regorafenib）主要用于KIT突变的GIST患者。近年来新获批的阿伐普利尼用于治疗PDGFRA 18号外显子突变的GIST，利培替尼用于已经接受前三种酪氨酸激酶抑制剂治疗的晚期GIST患者。但酪氨酸激酶抑制剂治疗，最终会导致KIT或PDGFRA继发性耐药突变，以致疾病继续发生发展。
因此，研究者们想要找到晚期GIST的新型治疗策略。转录因子在GIST的发生发展中起着至关重要的作用。通过转录组学分析，他们确定了一个新型且非酪氨酸激酶的靶标GPR20（G蛋白偶联受体20），这是一个有358个氨基酸的寡GPCR。GPR20的表达受转录因子FOXF1和ETS变异转录因子1的调控。
抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugates, ADC）是利用单克隆抗体的特异性，有选择性地向抗原表达的肿瘤细胞递送强有力的细胞毒性药物。它的作用原理如图，ADC与细胞表面抗原结合，内部化并易位至溶酶体室，溶酶体内的酶切作用使其释放出所附载的细胞毒性药物，从而导致细胞死亡。今天所介绍的ADC药物，伊西替康衍生物，是一类DNA拓扑异构酶1抑制剂，可使双链DNA断裂和细胞凋亡。连接抗体和药物的linker，马来酰亚胺GGFG四肽，可以被组织蛋白酶等，在肿瘤细胞中高表达的溶酶体酶切断。这种linker-payload技术可以达到稳定且较高的药物抗体比率。
首先研究者需要制备用于GPR20的ADC药物和免疫组化等使用的特异抗体。他们利用DNA免疫法得到了三个大鼠源的GPR20单抗，04-046、04-093、04-021，并通过实验验证了他们所结合的区域，04-046结合在胞外区1和胞外区2，04-093结合在胞外区1，04-021结合在N端结合域。使用Rat-ZAP来观察抗体的内部化活性，Rat-ZAP是一种偶联了皂草素的二抗IgG，皂草素是一种核糖体失活蛋白，有很强的细胞毒性。04-046有很高的内部化活性，可用作ADC药物的抗体，但还需进行人源化改造，降低免疫原性。另一个04-093适合用作IHC，后续改造成在实验中效果更好的兔单抗，04-093OcH1L1。
研究团队在美国的Dana-Farber癌症研究所(DFCI)收集了139个GIST样本，其中GPR20阳性的占91%，通过切片的免疫组化鉴定并统计分析，制定了如下的GPR20和KIT表达分级标准。统计分析发现，在KIT等级越高时GPR20高表达的比率越高，说明GPR20和KIT的表达呈很强的正相关。然后统计不同组织内的GIST样本发现，在小肠和腹腔中GPR20高表达，其中腹腔是转移病灶；按突变类型分类统计，KIT突变和KIT/PDGFRA WT GIST中GPR20表达量高，在PDGFRA突变的GIST中高等级GPR20表达为0，八例样本中七例GPR20阳性的PDGFRA突变样本都存在D842V点突变。接下来就KIT突变样本组进行细化的统计分析，KIT 外显子13/14是ATP结合域，17/18是激酶活化环，他们常见于酪氨酸激酶抑制剂导致的耐药突变，通过对比单个和两个KIT突变，可以明显观察到KIT外显子11+17突变比外显子11突变样本中有着更高比率的GPR20高表达。日本的东部癌症中心(NCCHE)共收集100个样本，与前统计分析有相似的结果，但外显子9突变中GPR20的高表达没有发现。统计正常组织和不同肿瘤的样本发现，GPR20只在GIST、ICC细胞和仅1例的平滑肌肉瘤中表达。在大于90%的系统性肥大细胞增多症中都能观察到KIT突变，但是没有GPR20的表达，说明KIT激活和GPR20表达没有明确的关联性。
DS-6157a的细胞生长抑制活性检测，使用稳转GPR20表达载体的GIST-T1细胞系和NCI-N87胃癌细胞系对照，流式分析可见在稳转GPR20的GIST-T1细胞系中，GPR20高表达，NCI-N87没有GPR20表达。DS-6157a所表现出的细胞毒性由附载的药物伊西替康衍生物提供，此抑制剂在两种细胞系中都有很强的抑制活性，但DS-6157a只在GPR20高表达的细胞系中有抑制活性，IC50为156ng/mL，表现出其特异选择性。
DS-6157a的作用机制。研究者通过在DS-6157a上标记pH敏感的染料，pHrodo，使用定时间隔成像分析，观察ADC药物的胞内运输情况。WB结果表明DS-6157a与Dxd一样，有着DNA损伤和细胞凋亡的细胞内毒性。同时其有着抗体依赖的细胞毒性，没有补体依赖性细胞毒性。
体内实验中，选择GPR20阳性的CDX和PDX模型验证DS-6157a的抗肿瘤活性。在GIST-T1/GPR20和GIST-T1的CDX模型中，静脉注射给药DS-6157a，表现出剂量依赖的肿瘤生长抑制，在3和10mg/kg剂量下可以观察到肿瘤消退。对比给药3mg/kg的两组肿瘤大小，可看出GPR20高表达的CDX是更敏感的。肿瘤组织WB结果中可以观察到给药后引起的DNA损伤和细胞凋亡标志物的表达差异。GIST1和GIST6 PDX模型中，可在给药10mg/kg剂量下观察到明显的肿瘤生长抑制。GIST6 PDX模型同时验证了GPR20抗体和IgG-ADC对肿瘤生长都没有影响。
接下来，研究者对比了DS-6157a和酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤活性。GIST#1001 PDX中DS-6157a在5和10mg/kg剂量下阻断肿瘤生长，与三个酪氨酸激酶抑制剂等效。GIST430/654是伊马替尼耐药的CDX模型，其含有伊马替尼的常见耐药突变，KIT外显子13的V654A突变，DS-6157在其中表现出比舒尼替尼和雷戈非尼等效或更好的抗肿瘤活性。GIST#1338 PDX模型，取自处于雷戈非尼治疗中的病人样本，在此DS-6157a展现出比另三种酪氨酸激酶抑制剂更好的抗肿瘤活性。
最后，研究者在食蟹猴和大鼠上对DS-6157a的药代动力学和安全性进行了测试。通过单静脉注射给药0.1-30mg/kg，检测其血药浓度变化，食蟹猴上的药代动力学检测结果表明，DS-6157a和总抗体的血药浓度情况几乎无差别，说明DS-6157a的多肽linker在血浆中非常稳定。安全性测试是在大鼠和食蟹猴上，利用间歇静脉滴注的给药方式，在各器官组织中检测毒性物质。结果表明在肠、肾等器官有极小或轻微的毒性成分。大鼠的STD10(10%动物严重毒性剂量)大于199mg/kg，其HED(人体等效剂量)为32mg/kg；食蟹猴的HNSTD(最高非严重毒性剂量)为30mg/kg，其HED为9.6mg/kg。这些非临床的毒性研究表明DS-6157a的安全性，同时为人体临床实验确定了1.6mg/kg的起始剂量。
综上，本文介绍了在胃肠道间质瘤中大量表达，且有选择性的新靶标GPR20。靶向此蛋白的抗体药物偶联物，DS-6157a，在GIST异种移植瘤模型中表现出很好的抗肿瘤活性，其中包含有酪氨酸激酶抑制剂耐药突变的肿瘤模型。食蟹猴和大鼠上的研究也表明他有很好的药物-linker稳定性和动物安全性。未来除继续推进临床实验外，还会深入分析研究罕见GIST亚群或有着RAS/Raf、PI3CA等基因突变的病例，进一步明确GPR20表达水平影响疗效的阈值。
参考文献
1. Kenji lida, et al. Identification and Therapeutic Targeting of GPR20, Selectively Expressed in Gastrointestinal Stromal Tumors, with DS-6157a, a First-In-Class Antibody-Drug Conjugate. Cancer discovery. 2021. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-20-1434.
2. Parslow A, Parakh S, Lee F-T, Gan H, Scott A. Antibody–Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 2016;4:14.
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