新探针 | 五羟色胺探针可实现活体动物五羟色胺信号的实时灵敏检测

注：新型GRAB5-HT 探针现已在bioRxiv的预印本上发布（点击阅读原文可跳转）。

人脑中有近千亿个神经元，而神经元之间的信息传递主要依赖于通过化学突触发挥作用的神经递质。精确地研究神经递质的动态变化对于了解神经系统的功能、研究神经疾病的起因和潜在治疗方法都具有重要的意义。五羟色胺，也被称作血清素 (serotonin, 5-HT)，作为一种重要的单胺类神经递质，调控一系列生理功能如心情、食欲、睡眠、学习记忆等；同时，在临床上很多常用的精神疾病治疗药物都靶向五羟色胺的信号通路，例如，五羟色胺转运体抑制剂 (selective serotonin reuptake inhibitor, SSRI) 可以用于治疗抑郁症。虽然五羟色胺具有重要的生理功能，但是其发挥作用的机制尚不清楚，其中很重要的原因就是缺乏同时具有细胞特异性及高时空分辨率的检测方法。

基于GRAB探针的开发原理，通过利用自然进化的五羟色胺G蛋白偶联受体在感受配体后会发生构象改变的特性，将其与循环重排的荧光蛋白偶联，把构象变化转换为可以检测的光学信号，开发出了可遗传编码并能够特异性检测五羟色胺的荧光探针，命名为GPCR-Activation-Based sensor for 5-HT，简称GRAB5-HT 。通过蛋白质工程的手段，对GRAB5-HT 探针进行了一系列的优化筛选，并最终得到了具有高特异性，高亲和力，亚秒级别反应动力学，以及高时空分辨率的五羟色胺探针。

图1 五羟色胺探针GRAB5-HT1.0 在体外培养的细胞中的特性刻画

GRAB5-HT1.0 探针在体外培养的神经元上对外源加入的饱和浓度的5-HT 可以达到~300%的响应，对应的作为对照组的GRAB5-HTmut （对5-HT不响应）则没有明显的荧光强度变化（图1b）。同时，该探针对5-HT具有较快的响应速度，可以达到亚秒级别（图1c）。除此之外，该探针还具有较好的特异性，只对5-HT有响应，对其它神经递质/调质则不响应（图1d）。

图2 应用GRAB5-HT1.0在小鼠脑片、果蝇以及活体小鼠检测5-HT的实时变化

将GRAB5-HT1.0 探针表达在小鼠脑片（图2a），同时使用GRAB5-HT1.0 探针与传统检测单胺类神经递质的快速扫描循环伏安法 (Fast Scan Cyclic Voltammetry，FSCV) 检测电刺激引起脑片内源5-HT的释放，GRAB5-HT1.0 探针相比于FSCV显示出更好的信噪比（图2b）。其次，将GRAB5-HT1.0 探针表达在活体果蝇大脑中（图2c），可检测到单颗五羟色胺能神经元释放的5-HT引起的荧光探针的信号变化。其中，电刺激引起的信号响应可达到~100%；气味刺激引起的信号响应能达到~50%；外源加入5-HT则能达到~300%的信号响应（图2d,e）。此外, 将GRAB5-HT1.0 探针表达在小鼠眶额叶皮层和终纹床核，对这两个脑区进行同时记录可检测到协同的五羟色胺动态变化，说明在睡眠状态下不同脑区的五羟色胺受到相对统一的调控（图2f,g）。

因此，GRAB5-HT1.0 探针适用于对活体动物五羟色胺信号进行实时特异的追踪，可以在复杂的神经网络中精确地检测五羟色胺的释放与调控，并帮助阐明其在生理及病理状态中发挥作用的具体机制。

感谢上海神经所的徐敏研究员、美国弗吉尼亚大学（University of Virginia）的J. Julius Zhu教授以及B. Jill Venton教授在本课题中的合作与支持！

本文中的GRAB5-HT1.0探针获取方式详见实验室网站：

http://www.yulonglilab.org/resources_cn.html