我说小鼠焦虑抑郁了！你问我怎么知道？（行为篇）
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作者：神雕不会飞
编辑：shin
抑郁症，是当下最为普遍的一类精神紊乱症。2010年，世卫组织预测，超过35000万人遭受着抑郁症的困扰。在物质文明的今天，大多数人已不再为一日三餐犯难，对于物质的追求是空前的，但过剩的物质财富却带来了更多更为普遍的焦虑、困惑、痛苦与抑郁。迄今为止，抑郁症的发病原因仍尚不明确，发病者的症状发展也各不相同。研究者们将抑郁症的起因归结为压力、药物及其滥用、认知障碍、遗传等部分或者全部的作用。
我们处在一个如此丰富的世界环境里，一个微小的因素也可能变成导火索，以至于想要在汪洋大海中找到千丝万缕的头绪就更是难上加难。人类为了找到这些疾病产生的原因及其病理基础，常选用实验动物，如：C57 BL/6J小鼠，作为研究对象，通过多种行为范式来模拟人类的精神病理症状。
尽管小鼠与人类在解剖结构、生理特性及神经化学基础等多方面十分接近，共享着超过90%的基因，其大脑结构也与其他哺乳动物具有同源性，但无论如何，我们也始终无法完全精准的把握或者衡量在小鼠身上表现出的人类精神病学症状，也无从得知这些动物症状与人类主观体验之间是否真的相互匹配。
Jacqueline N. Crawley等，在《What ’s wrong with my mouse?》 中写道：”Don’t
anthropomorphine ! Emotions are personal, internal, and highly species-specific.”无论人们设计出自认为多么精巧的实验范式，但却不得不承认，我们根本无从得知小鼠是否真的感觉到害怕、焦虑甚至抑郁。
What’s wrong with you or your mouse?
“你在想什么？”
很多时候，我们常常无从得知同性或者异性在想些什么，哪怕是语言，也常带来各种各样的误解，但尽管如此，我们仍能够通过表情、肢体动作，对方的精神状态等这些外在表象判断出个体的情绪，甚至预测对方的下一步动向。因此，对实验动物，尽管我们无法精准的感知其内在情绪，但仍能通过观察实验动物的行为与生理反应，找到动物抑郁样行为与人类抑郁症之间的关联。
可是，研究者们究竟是如何基于小鼠的生理特性和行为特征，判断小鼠是否“抑郁”了呢？
理毛（self-grooming）
健康正常的小鼠都会舔舐梳理自己的毛发，这一行为几乎贯穿着物种进化过程。是不是眼前浮现了“懒起画峨眉，弄妆梳洗迟”的画面感，小鼠也化妆？没错，小鼠不但自己给自己理毛，还给其它小鼠梳理（即social grooming）,它们喜欢相互打扮。可反常的过度自我理毛，整理胡须，或者放弃自我梳理，即被研究者们视作异常行为。
图1. self-grooming行为
Allan V. Kalueff 等人，在近十年的研究中分析了小鼠的理毛行为与动物应激、焦虑样及抑郁样之间的关系，结果发现，当对正常小鼠使用能产生焦虑的药物戊四唑pentylenetetrazole之后，小鼠的理毛次数及时长较对照组而言显著升高，且成剂量依赖关系。同时，他们还发现，当再对小鼠使用抗焦虑药物---安定diazepam后，小鼠的理毛时长及次数（在药效范围内）接近正常小鼠的理毛水平。
体重（Body weight）及排泄（defecation）
1915年生理学家 Walter Cannon 指出，动物的情绪反应对动物个体的胃肠功能有着十分重要的影响。肠脑轴通过神经网络、激素水平、循环系统不断地交换信息，对外界刺激及感知做出相应的变化。因而，在发生应激、产生焦虑样、抑郁样行为的个体中常形成精神性厌食症、暴食症等，导致动物体重失衡，排泄量增多等等。故，我们总能通过观察发现，在一定条件下，小鼠真的“吓尿了”，“吓屎了”！而这同样适用于人类。当个体承受过多压力，或者产生焦虑、抑郁情绪时，常常伴随着腹泻、胃痛等炎症性的胃肠道疾病。故此，研究者们常能通过旷场实验，观察小鼠在一定时间内，在旷场中心区域及周边区域的停留时间，记录小鼠的排泄情况，进而评价小鼠的焦虑样行为。同时，值得注意的是，体重变化与排泄量的改变多少，仅能作为评价实验动物抑郁样行为的相关参考，而不能完全作为评价动物抑郁模型成功与否的指标。
强迫游泳（The forced swim test-FST）
图2. 强迫游泳试验中，小鼠分别处于不动、游泳、攀爬状态示意图
1977年，科学家Porsolt R D等，首次通过强迫游泳的动物模型评价了抗抑郁药物的作用，因此，该范式又称为The Porsolt forced swim test。该实验基于小鼠天生厌恶游泳的特点，将小鼠放入局限且不可逃避的压迫环境，正常状态下，小鼠将通过游泳在水中寻找逃生路径，设计出行为无助情境，以衡量小鼠的抑郁样行为。在实验中，将小鼠放入水中强迫游泳6至20分钟，通过记录：1）.不动时间：即小鼠在水中停止挣扎，仅将头露出水面漂浮的时间；2）.游泳时间：即小鼠四肢划动、拍打及俯冲时间；3）.攀爬时间：小鼠抓爬玻璃缸壁的时间。一段时间后，抑郁样小鼠将表现为停止游泳，漂浮在水面上，表现为“放弃寻找逃生径” 的 “behavioral despair” 行为绝望。1995 年，Irwin. Lucki 等人在实验中研究了四种不同的抗抑郁药物desipramine (DMI)、fluoxetine (FLX)、sertraline (SRT)和 paroxetine (PRX)对大鼠在强迫游泳实验中“行为绝望”状态的作用。结果发现，四种抗抑郁药物均能显著减少大鼠在水中的不动时间，增长在水中游泳时间，使实验动物从被动放弃状态转变为积极求生状态。
悬尾试验（The tail suspension test）
图3. 小鼠悬尾试验示意图
早在1985年，Steru L.等人，就已将悬尾试验应用于评价实验动物的抑郁样行为，而其实验原理及评价方式与前文所述的强迫游泳实验十分相近。然而，直到2000年以后，研究者们才开始广泛使用这一实验模型，并发现对有抑郁样行为的小鼠注射抗抑郁药物之后，确实能够缩短小鼠在悬尾试验中的不动时间。该实验将小鼠从尾部悬起倒挂在离地近10cm的箱中5-8分钟，使小鼠无法接触地面。通过监控观察并记录小鼠放弃挣扎并保持不动状态的时间。尽管小鼠无法告诉我们感受，也无法被临床诊断为抑郁，但对比其使用了抗抑郁药物前后的行为表现，我们总能得到些启示。在悬尾试验与强迫游泳实验中小鼠所表现出的Immobility（不动）状态，被研究者们视作实验动物不想为逃跑做出任何努力而表现出的绝望行为。正如抑郁症患者，在面对压力或者其他困难情境时所表现出的消极被动，放弃做出任何努力去改变现状的行为和机会一样。Todd D. Gould 等人，在研究中发现，在悬尾试验中，与对照组--表现为抑郁样小鼠相比，通过抗抑郁治疗能显著缩短小鼠在实验中的不动时间，表现出更多的挣扎逃脱行为。
糖水偏好实验（Sucrose Consumption Test）
图4. 糖水偏好示意图，surcose-1%蔗糖溶液，water-饮用水
蔗糖偏好，是基于小鼠对甜味偏好这一特点，评价实验动物抑郁样行为及抗抑郁药物效果的又一衡量方法，当然这一理论是建立在大多数实验动物均偏好甜味的基础上发展而来的。快感缺失，是精神疾病及行为障碍的重要特征。这也是大多数抑郁症患者所描述的“世界是灰色的，我感觉不到什么是快乐”！同理，当小鼠出现抑郁样行为时，其对糖水的偏嗜度也随之降低。在为期3~7天的实验中，对造模后的小鼠给予双瓶饲养，其中一瓶为1%蔗糖水，另一瓶为饮用水。在整个过程中随机调换两个水瓶的位置，以防止小鼠的位置偏爱效应。每天记录小鼠饮用两瓶液体的饮水量。通过计算小鼠对蔗糖偏爱度%=糖水消耗量 / ( 糖水消耗量 + 纯水消耗量) × 100% ，以此表示小鼠对蔗糖的偏好程度。Xin-Yun Lu 等研究发现，由慢性社交挫败导致的小鼠抑郁样模型中，小鼠对蔗糖的消耗量显著减少，且与正常小鼠相比，差异表现为显著。
社交活动试验(Social international test)
大量研究表明，严重焦虑患者或抑郁症患者，在社交活动中表现出更多的社会逃避行为，并导致沟通障碍。这也是抑郁症患者常常表现出“与世隔绝”的典型症状。基于此，研究者们设计了Social international test 以评价抑郁样动物的社交行为变化及抗抑郁药物的效果。
该试验主要用于衡量社会挫败（social defeat）及慢性社会挫败应激（CSDS）导致动物抑郁模型的社交行为变化。测试主要在对小鼠社会挫败24小时后进行，在之前的CSDS模式下，小鼠每天分别从生理上和心理上，承受着比它大几个重量级且不同的CD-1鼠“恐吓”与“震慑”。在造模结束之后，让新的CD-1鼠与小鼠仍然同处一室，但不同的是，在社交活动试验中，将 CD-1鼠用透明可视的隔离罩限制固定在一端，而小鼠能够在区域内自由活动。监测并对比在一定时间内，小鼠在有无CD-1鼠存在的情况下，在区域内的活动情况，并记录小鼠在交互区（interaction zone）与角落（Corner zone）的停留时间。
图5. 社会挫败与社交活动试验示意图。首先进行CSDS试验，连续10天用CD-1鼠 “震慑” C57 BL/6J 小鼠，随后进行社交活动试验。
结果发现，经历了CSDS而产生抑郁样行为的小鼠在社交区停留时间较无CD-1鼠存在条件下的时间显著减少，而更长时间停留在角落。也就是说，抑郁样小鼠的社交行为较正常小鼠显著减少，这与在人类临床表现出的抑郁症状十分相似。同时，这种由社会挫败造成的实验动物抑郁样行为---社交能力下降，能够在对实验动物给予抗抑郁药物后得到明显改善。
穿梭箱试验（Shuttlebox test）
图6. 小鼠在斯金纳箱中接受足底电击，形成习得性无助抑郁示意图
1967年，著名的美国心理学家 Seligman 和 Overmier 提出了经典的习得性无助理论（Learned helplessness），在他们整个研究生涯中做了大量关于习得性无助的研究。在习得性无助研究行进的初期，主要以狗作为实验对象，直到80年代，科学家们才开始以小鼠作为主要研究对象。在实验中，将小鼠分为三组，分别为对照组Control、可逃避组Escape与不可逃避组Inescape，让ES组与INES组小鼠在斯金纳箱中接受足底电击（foot shock），不同的是，ES组小鼠可以通过学习，关闭电击，即电击一来，就能操作开关关闭电击；而INES组小鼠，则不能通过任何方式躲避电击。通过一定时间的造模训练，INES组小鼠则将因为持续的厌恶性刺激，形成一种对现实无望且无能为力的行为、心理状态，进而导致实验动物产生抑郁样行为。
那么，在这种行为范式下形成的习得性无助或者习得性抑郁，我们又如何得知小鼠是否真的抑郁了呢？
为了探究习得性抑郁是否能在不同的情境中迁移以及小鼠是否真的存在抑郁样表现，于是研究者们设计了穿梭箱试验（Shuttlebox test）。穿梭箱是以声、光、电击为联合的刺激，使实验动物由被动回避建立主动逃避的条件反射，属于经典的联合型学习条件发射。当动物感觉到危险或受到厌恶刺激后，出于本能反应，会选择逃跑。人也是一样。因此这类试验，均建立在正常状态下，实验动物有意愿并能够逃离厌恶刺激的假设基础上。
图7. 小鼠在穿梭箱试验中示意图，当小鼠在箱内一侧受到足底电击，能够通过逃入对侧箱中躲避电击，即一旦小鼠逃进穿梭箱的另一侧则电击停止（成功逃避）
在试验中，将三组小鼠：对照组（control-Naive）、可逃避组（ES-non learned helplessness-NLH）与不可逃避组（INES-Learned helplessness-LH）小鼠分别放入穿梭箱，在相同的实验条件下，分析小鼠不能逃避电刺激的失败次数，及逃避潜伏时间。结果发现，对照组与可逃避组小鼠均能够学会并能够快速逃避足底电刺激，而不可逃避组小鼠不能有效的逃脱足底电刺激，表现为更多的被动忍受与无助，结果如图8所示。
图8. 穿梭箱试验中，小鼠失败逃避电击的次数（左），及逃避潜伏时间（右）
由此联想到我们自己，在很多情况下，我们都仍是生活的学习者，每每遇到困难，谁都会有无助无奈的时候。但也许生活就是场设计巧妙的游戏，它总是需要我们花费极大地耐心，与长久的毅力，才能发现生命背后的秘密，战胜那个隐匿于无形中，强大的游戏设定者。
希望你能一如既往的勇敢！
写在最后
在实验中，由于很难基于单一的行为测试就能恰如其分的理解动物的行为，并且，并非在此过程中，实验动物所有正常行为的改变都代表着动物产生了焦虑和抑郁样行为，例如：C57 BL / 6J小鼠在理毛行为中就常被称为“小鼠中的理发师”；还可能包含着多种实验条件或环境的影响。因此，在衡量评价实验动物的行为时，常常采用多种指标联合分析，同时结合相关生化指标，最终得出相对正确的实验结论和评价结果。
参考文献
1.《What’s wrong with my mouse?-Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout mice》, written by Jacqueline N. Crawley, Phd.
2. Tao Yu, Ming Guo, Jacob Garza, Samantha Rendon, Xue-Li Sun, Wei Zhang, and Xin-Yun Lu., Cognitive and neural correlates of depression-like behaviour in socially defeated mice: an animal model of depression withcognitive dysfunction. Int J Neuro psychopharmacol, 2011, 14(3): 303–317. doi:10.1017/S1461145710000945
3. JF Cryan and C Mombereau. In search of a depressed mouse: utility of models for studying depression-related behavior in genetically modified mice., Molecular Psychiatry , 2004, 9, 326–357
4. Hee-Dae Kim, Tanessa Call, Samantha Carotenuto, Ross Johnson and Deveroux Ferguson., Testing Depression in Mice: a Chronic Social Defeat Stress Model, Bio-protocol, 2017, 7 (07), DOI:10.21769/BioProtoc.2203
5. Jin Yong Kim, Soo Hyun Yang, Jihyun Kwon, Hyun Woo Lee, Hyun Kim., Mice subjected to uncontrollable electric shocks show depression-like behaviors irrespective of their state of helplessness, Behavioural Brain Researchm, 2017, 322, 138–144
6. Michael J Detke, Michael Rickels, Irwin Lucki., Active behaviors in the rat forced swimming test differentially produced by serotonergic and noradrenergic antidepressants, Psychopharmacology, 1995, 121: 66-72
7. Kalueff A.V., Problems of the study of stress-related behaviour. Kiev: KSF, 1999
8. Allan V. Kalueff and Pentti Tuohimaa., Experimental modeling of anxiety and depression, Acta Neurobiol Exp, 2004, 64: 439-448
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