Western百败百战老学姐的心酸笔记
作为一枚资深伪文青，平常小笔最爱的莫过于看风景、弹古筝以及毫无逻辑无病呻吟（哈哈哈，人生最大幸事，没有之一）。然而小笔的正业却是严谨的科学探究（是不是想翻我个大白眼），没错，就是这么神奇的切换。
那么，作为在科研之路上摸爬滚打多年的老学姐，很想和大家吐槽吐槽一路走来遇到的奇葩事，以及从中汲取的经验咯，今天就先来聊聊我第一次触电的western吧。。。
说起western，大家再熟悉不过，是业内大部分专业的基础入门级技能。小笔第一次来实验室接触的就是它。相信很多新手宝宝和小笔一样，第一次看师兄师姐捣鼓一天，又是稳压跑蛋白又是稳流转蛋白，然后还要在冰箱里面摇着过夜，脑子彻底懵圈了。等好不容易理顺了过程，又有新的问题层出不穷。明明和师兄师姐步骤一样啊，啥都一样啊，为啥结果就是不对呢，或者是没有呢？天理何在？默念是不是该走一趟灵隐寺？
作为曾经一个月半根条带都爆不出来的小笔，经过失败，分析，整理，再失败，再分析的过程，积攒了一些经验。具体的操作过程就不赘述，毕竟度娘啊什么的比我强大的多，在此强调一些易被忽视的细节，并分享一些我的经历，供大家举一反三：
做胶总是漏，蛋白跑的总是丑：相信这是很多初学者常遇到的问题。明明玻璃洗的很干净啊，明明加水使液面平整了啊，明明是混匀后才做的胶为何跑出来的蛋白歪歪扭扭。。。其实这很简单，就是认真的态度和细心的双手。
这些操作都很容易，基本上没有技术难度，但是也很容易出问题，比如胶的液面为何不平，常常是因为你加双蒸水的时候力道太大，而胶相对凝固的时间较短，液面不平是理所应当。所以细心和耐心非常重要，心急吃不了热豆腐哒。
如何快速又稳定的跑蛋白呢？电压过大，产生的热量也会很高，温度太高会影响某些目标蛋白的表达并且跑出来的条带很丑，而一直低电压所耗费的时间不少。
以小笔和小伙伴们的经验，一般在电泳槽内放上一个冰袋用于降温，同时采用70V恒压,30min; 随后200V恒压, 时间根据所需蛋白分子量来定。
上述步骤都只须动动手指头就分分钟搞定，为了做一个高效的科研狗，此刻你应该做的是配置好转膜液，并偷偷告诉你，转膜液于-20℃冻存备用（提高转膜效率，一般人我不说哦）。
友情提醒，一定要盯牢你的蛋白marker跑到了什么位置，不然就要game over了，不要问小笔怎么知道的，往事不要再提。
蛋白转到了滤纸上？！没错，就是这么任性。小笔在此分享的是湿转法：请认准“黑胶白膜”经典套餐，滤纸的长宽比胶小2 mm左右，而膜的长宽比胶大2mm左右，绝对避免上下两层滤纸接触而引起短路，并按照图所示对好正负极后，再接通电源。
如果电压接反或者膜和胶的位置放反了，就会出现蛋白跑到滤纸的情况。操作该过程尽量使用干净的手套。其实也是一个细心的问题，鉴于我的大大咧咧，在此问题上也出过不少差错。
封闭液选择？一抗的时间到底有没有要求？是不是孵育时间越久越好？一般用BSA或者脱脂奶粉，我们实验室多采用脱脂奶粉，封闭后背景比较干净（但在检测磷酸化蛋白可以采用BSA，因脱脂奶粉含磷酸化蛋白会造成干扰）。
师妹曾把一抗放在4℃冰箱摇了3天。。。然而并没有什么卵用，甚至有些蛋白反而爆不出来了。一般来说，当天想要出结果，在室温孵育3-4小时即可。时间不够的话室温孵育1小事后4℃冰箱过夜就妥妥的了。
啥么都一样，为何换了一个环境，蛋白就出不来了呢?!这个问题，小笔。。。说起来就有点复杂了，小笔老板当初从美国回来开办实验室的时候，明明带着成熟的western protocol，也摸索了大半年才建立起了完善的western体系。
小笔当初从我们的一个实验室去到另外开辟的新的实验室的时候，也是一个月没有做出来结果，而且好几个人都没有结果。说起来玄乎，其实这其中也是有着各种各样的小问题和小方法的，活学活用，因地制宜还是很重要的。
其实western的方法和攻略，网上总结的很多很多，我的分享只是九牛一毛。为何没有大篇幅的来讲，其实也是想起到抛砖引玉和启发的作用。毕竟，问题形形色色，各不相同，关键还是要去摸索，用看韩剧的热情去挖掘实验的精华，用打魔兽的激情去战胜这些所谓的bug。
小笔是一枚伪文青，用的是看风景的心情，弹古筝的专注，和“无病呻吟纸上谈兵天马行空”的开阔思维，努力奋斗在科研的路上（咳咳，夸的好像有点过了，面壁去）。
只想做个闲人，对一张琴，一池荷，一溪云…做实验？？oh no，这也太煞风景了，让我静静，下次见。
小笔，我浙药学院的一名普通老博，“长期奋斗”在肿瘤药理及神经药理学领域，经常跟老鼠细胞啥么的打交道，不过马上要滚蛋了，但仍然会活跃在这几个领域继续做实验，聊八卦。其实小笔最初的自我定位是成为一枚文艺女青年，不过每天在实验室泡着久而久之也就只是枚伪文青了。小笔想用一颗文艺加逗比的心，把枯燥的实验操作转化为轻松清新的语言传递给大家，生活还是可以很美好，课题实验也还是可以继续哒!
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