一场大病引起的诺贝尔2017年生理学奖角逐

诺奖得主Michael Rosbash今年在Cold Spring Harbor Perspectives发表的回顾节律研究历史的文章（A 50-Year Personal Journey: Location, Gene Expression, and Circadian Rhythms 50年的个人旅程 - 定位，基因表达，节律系统）；另外一个诺奖得主，也就是Rosbash和Jeff的竞争者，Michael Young是本文的编辑之一。

Michael Rosbash回顾了自己的学习和研究生涯，借古讽今的戏谑了现在的唯文章是用；阐述了一个科学家受到爱好的驱动，朋友的驱动和疾病的驱动，在几近不惑之年克服自己的拖延症转向诺奖领域的故事；最后总结了当下节律研究还存在的问题，以及下一步的方向和对果蝇解决睡眠问题的信心。

个人理解的三位诺奖获得者研究取得成功的关键是对新技术的密切跟踪和大胆应用。Michael Rosbash还有其跨学科背景、对问题的把握、对自我的不局限。

引子

从19岁到38岁，从大学生到成为副教授，我的研究工作都定位于核酸和基因表达。导师对我研究方向选择有重大的影响。而我在布兰迪斯大学的同事说服我遗传学是研究基因表达的重要工具。于是我选择酵母作为研究对象。几年后，又是友谊的小船把我带向了节律系统的研究。幸运的是，遗传学和基因表达对周期节律的研究是很关键的。这些研究背景和训练使得我的实验室在节律系统的研究上处于领先地位。这篇故事的寓意与房地产的逻辑是相似的，location, location, location，环境，定位，方向。(不知道定位是否还暗含定位基因的意思)

学习生涯 (身边的大牛系列)

作为布兰迪斯大学38岁的终身教授，是为什么和怎样在1982年把研究工作转向昼夜节律的研究的呢？在那个时期，节律系统领域的领军人物要么自身是做节律的要么是做神经科学的。而我却很独特。我1964年毕业于加州理工化学系。随后在诺曼戴维森实验室和罗伯特实验室研究核酸。Reg Kelly是我当时在罗伯特实验室的导师；他后来去了UCSF，成为了一名著名的细胞生物学和神经生物学家。我随后去了巴黎，在Marianne Grunberg-Monago实验室研究蛋白合成。Marianne是纽约大学的Severo Ochoa的博后（Ochoa与Kornberg1959年因RNA和DNA的生物合成的研究得诺贝尔奖）。我当时的导师是Cal McLaughlin，后来与Jon Warner和Lee Hartwell在蛋白生物合成研究中做出了重要贡献。后来我回到麻省理工读生物物理博士学位，师从转向mRNA的细胞生理学研究的前物理学家Sheldon Penman；20世纪50年代沃森和克里克的研究激励着Sheldon和他的导师Jim Darnell从病毒和细菌的基因表达研究转向真核生物的RNA和蛋白的合成。在MIT，我的研究方向是组织细胞培养和病毒中膜结合蛋白的合成，课题是核糖体是如何结合到内质网上并参与到分泌蛋白的合成的。MIT汇聚了很多聪明的学生和教员，当然也包括Sheldon。他还是一流的导师，培养了包括Bob Weinberg（也是Robert Weinberg，著有Hallmarks of Cancer）和Rob Singer(单细胞和单分子研究)在内的一批学生和博后。

随后，我去爱丁堡大学研究表观遗传学的John Bishop实验室做了3年博后。表观遗传学是著名发育生物学家C.H. Waddington（常见的小球滚下山寓意发育的不可逆的模型的首创者）创造的术语。当人们意识到基因的扩增和删除不在是不同发育时期或组织器官基因表达不同的主要调控机制时，表观遗传或者差异基因表达一定是主要调控机制。我的导师Bishop不只是对基因表达感兴趣，而且对开发研究核酸的方法感兴趣。那时他还在亲自做实验并且比Penman更像一个生化学家。除了John和他的实习生，爱丁堡大学充满了有趣的人和科学研究，他们中的大部分在我随后的职业生涯都有积极的影响。比如发明了Southern blot（再也不能翻译为南杂交了）的Ed Southern](https://en.wikipedia.org/wiki/Edwin_Southern) (也是DNA microarray的发明者,2005年拉斯克奖)是爱丁堡大学内我们临近实验室的负责人。这个领域另外两个重量级的人物是Max Birnstiel实验室的Adrian Bird （CpG岛的发现者，关注甲基化、MECP2和Rett syndrome，2013年引文桂冠奖，2016年邵逸夫奖） 和Michael Grunstein（表观遗传与组蛋白代码，第一次发现组蛋白是细胞内基因活性的调节子，常与David Allis一起获奖）。

1974年秋天，我去了布兰迪斯大学任助理教授。当时已经30岁了，也从加州理工毕业9年了。这是那个年代研究人员的标准轨迹，并且几乎没有人离开这个直接而单一的路线：大学-研究生-博后-教职；只是研究生和博后阶段比现在要短很多。当时西方世界正在经历战后发展，没有人为找工作担忧。我们都认为没有解决不了的事，看上去也确实如此，起码对大部分人来讲。30岁生日时收到密友的生日贺卡，上书The world is your oyster，寓意可以随心所欲。事实也是如此。

在这些逝去的美好的时光里，很多杰出的新PI在博后期间都没有产出，文章多发表于他们第一个教职期间，并且都没有博后导师的名字。例如我在布兰迪斯大学的好友和合作者Jeff Hall以及他的合作者Doug Kankel。Hall和Kankel是加州理工Seymour Benzer的博后，他们在1976年发表的文章中的工作大部分都是在Benzer实验室完成的。这一情况也适用于这个领域其他杰出的研究者。比如Mike Young离开斯坦福的Hogness实验室加入洛克菲勒时也没有包含Hogness名字的一作文章。尽管这不适用于所有人，但那个时代与当下看重文章的风气很不同。

研究方向小转，跨学科糅合

我在布兰迪斯大学的计划是继续我博后期间的研究，继续研究非洲爪蟾卵子发生和早期胚胎发育阶段基因表达的变化。这个工作开始与隔壁Max Birnstiel实验室的博后Peter Ford合作。我博士后期间的导师John Bishop是一个特别开放的人，可以让我选择任何感兴趣的方向和选择任意的合作方式。1974年10月一到布兰迪斯大学就开始了这个课题的研究。而且在离开英国前就提交了这个课题的NIH R01基金申请。在我到达布兰迪斯大学时，基金也同步到位。这也从另一个角度说明40年前的科学生活是多么地直接简单。我的第一个学生和博后都在这个方向取得了很不错的结果。尽管如此，我自己的不安分和两个外部因素促使我拓展新的研究领域。（这种不安分更多的驱动于我广博的兴趣）。

第一个因素是DNA重组技术的诞生。DNA重组技术最开始发表于我读博后期间，几年内几乎无争议的就从概念理论发展为很多研究团队和药厂必须的技术。现在科研圈对基因组编辑的争论和期待，与当年DNA重组引发的轰动效应一致。DNA重组技术的优势是使得研究单个基因而不是基因集或RNA群体的功能成为了可能。

我采用DNA重组技术是有着近水楼台优势的。在斯坦福Hogness实验室做博后时接受过DNA重组技术训练的Peter Wensink受聘于布兰迪斯大学。斯坦福是DNA重组技术诞生和付诸于应用的发源圣地。Peter的到来与我不谋而合，受益于罗森斯蒂尔基础医学中心开放的格局，我们的实验室也相邻。Peter从斯坦福带来的试剂和经验降低了使用这一技术的门槛。就像生信宝典降低了大家学习生信的门槛一样。

第二个因素是我被遗传学的魅力所诱惑。现在的研究者自然的认为基因表达的研究与遗传学不可分割。（遗传学=研究基因=研究基因组=研究基因表达）。然而，40年前，DNA重组技术出现前却不是这样。遗传学那时的定义很窄，局限于研究染色体或减数分裂，或者被视为一个策略，如利用突变体研究特殊问题。我曾在MIT和爱丁堡研究基因表达，但对把遗传学作为一种研究策略却没有任何经验和兴趣 （例如：非特异性的诱变个体，选择关注的表型，鉴定诱导表型变化的基因）。

现在很多人把这个定义为正向遗传学 (forward genetics)，对应于精确突变某个基因的反向遗传学 (reverse genetics)。因为反向遗传学需要克隆和测序DNA或特定的寡核苷酸片段来指导突变，这在DNA重组技术出现前和出现的早期是不能实现的。所以那时只有正向遗传学或简单的称为遗传学。重要的是，我在苏格兰和后来在布兰迪斯大学早期的研究中都是用非洲爪蟾的卵子和胚胎作为模式生物和系统，都不适用于正向遗传学研究。

在1974年秋天，到达布兰迪斯大学后不久，我正式转向遗传学。这主要得益于我与两个遗传学先驱Jeff Hall(也是此次的诺奖得住)和Lynna Hereford的友谊。Jeff比我早几个月成为布兰迪斯大学的助理教授，Lynna于1975年搬到我实验室。Jeff和Lynna是美国第一个遗传系华盛顿大学遗传系的博士生。在结识Jeff和Lynna多年后，我还在想华盛顿大学遗传系给毕业生授予神学和博士学位，向整个国家的生物学界里像我这样平庸的人传递遗传学的福音。

为了促进我对酵母的研究和Lynna对核酸研究的兴趣，我们首先合作解决酵母基因表达中的普遍问题，即酵母基因组编码多少蛋白编码基因。为了这个目的，Lynna和我采用我在苏格兰时辅助发明的用来研究真核基因表达的核酸重联动力学技术。基于重联动力学，我们开发了克隆特定基因的技术。随后克隆了组蛋白基因和核糖体蛋白基因。Lynna研究前者，我研究后者。

在20世纪70年代后期，我开始研究这个问题时，就已经对核糖体蛋白的表达有很大的兴趣。真核生物中大约有80个相关的核糖体蛋白。我关心的两个问题是：它们在核糖体中的配比如何、这一配比是如何被调控的。这个在文献中有一些有意思的报道。John Warner和他的同事发现一系列温度敏感的酵母突变体（当时被称为RNA突变体）中对核糖体蛋白的合成存在选择偏好。

握有新克隆出的核糖体蛋白和刚出现的northern杂交技术，我们可以探索酵母在异常温度培养时RNA图谱的变化。尽管成熟的核糖体蛋白mRNA快速消失（这与预期是一致的），新的大分子量的东西确出现了。最后证明这些东西包含内含子，我们尝试提出几种解释。第一，突变体影响的是转录后调控而不是转录调控；第二，突变体可能影响mRNA前体的剪接；并且鉴定了一系列可能与这个最近才发现的神秘过程相关的基因；第三，核糖体蛋白基因富集含内含子的基因，这可能可以解释核糖体蛋白合成的选择性。在那之前，肌动蛋白基因是唯一报道的含有内含子的基因。

所有的这三个预测最后证明都是对的。虽然现在原因还不清楚，大约2/3的酵母核糖体蛋白基因包含内含子，而只有5%的总酵母基因包含内含子（3%的非核糖体蛋白基因包含内含子）。这也解释了核糖体蛋白合成突变体的特异性。更重要的是，这个RNA突变体，后来被命名为PRP突变体（Pre-mRNA processing mutants），被认为是识别剪接复合体，和不同剪接蛋白复杂功能的重要切入点。这个RNA/PRP突变体也是我研究剪接问题的契机，从那之后，我在这个领域研究了20年。

在不同温度下培养突变株来研究体内事件随时间变化的方式取得了很多成果。同样重要的是，当与体外的剪接实验联合研究时，突变株被证明是无价的。在体内研究机制是很困难的，而提取液就会方便些。例如，可以使用缺少某个蛋白的提取液在体外做实验，随后再用重组蛋白或蛋白复合体回补功能缺陷。意识到这种可能性，John Abelson在听到我们的体内实验后，在1980或1981年来到我的实验室访问。他和他的同事Christine Guthrie成为这个领域的领军者，培养了很多酵母和剪接领域的重要人物。我自己的人也对这个领域有重要贡献。

在建立了酵母作为研究核糖体蛋白基因表达的模型后，我想在更高等的真核生物中研究核糖体蛋白的表达。最后选择了果蝇作为研究对象。随后，我们克隆了第一个后生动物的核糖体蛋白基因，rp49. 它的mRNA现在还是世界很多研究果蝇基因表达的标准参照。这个基因也用来展示一个minute突变体也编码核糖体蛋白。这一研究给果蝇突变体与基因产物之间第一次建立了联系。

诺奖工作开始的前因后果及竞争

虽然rp49的工作把我引向我的朋友和同事Jeff Hall研究的物种，但他对我在核酸和基因表达的工作不感兴趣，也没有深入地关注。我也对他在布兰迪斯的实验室研究的果蝇的求偶行为和神经科学没有兴趣。因此我们的友谊局限在对运动、音乐、左翼政治和常识性科学问题和八卦的探讨上。而且，我们在来布兰迪斯之前的研究背景有些重叠。我也认识很多Jeff在Seymour实验室的朋友，包括在加州理工毕业后去了耶鲁的Doug Kankel，和去了普林斯顿的Chip Quinn，和Bill Harris。Ron Konopka和Benzer发表于1971年的文章有些争议地开创了果蝇节律研究领域。之所以说“争议”，是因为早期Pittendrigh在拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)的研究的贡献。因为经常听Jeff提起Ron的故事，这篇文章也激发了我对节律研究的兴趣。但因为缺乏共同的背景，我跟Jeff的实验室并没有展开合作。后来发生的几件事或多或少的改变了这个局面。

首先，Bambos Kyriacou，Jeff实验室的博后，在果蝇的求偶行为和节律之间建立了联系。Bambos发现了雄性扇动翅膀向雌性演奏的求偶歌会受到Konopka period突变体的影响。这篇文章揭示了，这首歌不只是有物种特异的音调（频率），而且还有韵律。频率为40毫秒每次，周期为1分钟。特殊地，这个周期受到period突变体的控制；例如，短周期突变体的周期为40秒，长周期突变体的周期为80秒。说这些的关键点不是为了说求偶歌，而是说那时在Jeff的实验室，节律系统已经研究的比较活跃了。这提高了Jeff对求偶行为之外的节律生物学的兴趣和我对这个问题的兴趣。

其次，重组DNA技术取得了重大发展。在1980s，斯坦福的Hogness实验室引领的染色体步移技术使得克隆果蝇的period基因成为可能。而基因的鉴定可以通过Rubin和Spradling刚刚发表的遗传互补实验来实现。虽然我的实验室并没有从事这些研究，但我们熟悉其它DNA重组技术。它们技术之间的差别并不是太大。因此，1982年春天的一次篮球赛后，我建议Jeff一起合作。先定个小目标：克隆和测序可能有助于了解period的功能，进而了解节律钟的调控。然而万事俱备，还差东风，需要一个新人来开始这个课题。

第三，在1970s和1980s，我在罗森斯蒂尔中心未能获得终身职位。这里面有很长的历史，但相关的部分是我的实验室被迫搬到生物系，Jeff实验室旁。不用说，这种临近关系和多年我们一起开的联合组会催化了我们的合作。

第四，1982年夏我遭遇了严重的健康危机，这迫使我加快了重大决策的过程，包括一旦发现对这个方向感兴趣的人就开始在period基因的克隆。

第五，更严重的健康危机提供了合适的人选和开展period克隆的机会。Vivian Ernst是布兰迪斯大学出色的年轻助理教授，于1982年9月悲剧地死于乳腺癌。她的追悼会是我在家养病6个月后返回工作的第一天进行的。我小心地穿过校园，走向教堂，又缓慢悲伤地返回实验室。这时有个二年级的Vivian的研究生，Pranitha Reddy在等我。眼泪还在眼中打转，她问我，可否在我实验室继续论文。我把period的克隆工作交给了她，于是我跟Jeff Hall在节律系统研究的合作在1982年秋天开始了。

我们实验室第一个十年的研究都在文献和其它二手资料中有很好的梳理。在我看来，没有多少需要增加的。但是有一些奇闻轶事大家可能感兴趣。

在开始的几年里，我们跟洛克菲勒的Young实验室陷入了激烈的竞争中，period的克隆和回补实验在两个地方同时独立开展。Mike和他的同事们在这个领域做出了突出贡献。竞争虽然让人讨厌，但也促进了这个领域快节奏的发展，促使了我们的一些成功。

这里面也有一些错误。我个人认为，在早些年里，我们最大的贡献是一篇阐述period基因编码蛋白多糖的生化文章。这个基因编码一个孤儿蛋白，不包含与任何已经功能蛋白相似的特征。绝望之际，我们被period蛋白中唯一的特征甘氨酸-苏氨酸（GT）重复序列蒙蔽。这些序列通常存在与蛋白聚糖中，并且是氧连接的糖基化位点(O-linked glycosylation)。如果果蝇的period蛋白是蛋白聚糖，那么他的生化特征可能与这种翻译后修饰一致。尽管我在分子生物水平比Jeff或者我们组的任何一个人都好，但我也悲剧的没有蛋白生化知识。考虑到前面提到的竞争问题（Young实验室也在解决蛋白聚糖假设），我当时太轻率地接受和推进了我们的生化试验。我仍然不知道那些试验是否弄错了还是就应该那么解释。除了蛋白聚合的结果，我怀疑试验其它内容的正确性。不管哪个情况，蛋白聚糖假设在当时是有市场的。重要的是，当时没有很强的证据或其它有说服力的假设。

直到另一个基因singleminded编码的蛋白序列的发表，情况发生了改变。singleminded编码细胞核转录因子，与period蛋白同源。虽然同源性不高，并且同源区是很多不同功能蛋白共有的序列motif。但是它提出一个有竞争力的假设，period蛋白可能是转录因子。这个可能性，与我的博后Paul Hardin发现的果蝇脑中period mRNA水平的节律性变化一致。Paul在这一发现中做出了突出的贡献，包括使用果蝇的头而非整个身体来提取RNA。特定身体组织缺少节律性而中和了节律变化使得结果不太明显以致不可信。重要的是，RNA的周期变化受到per错义突变的影响。就像它们对行为周期的影响一样，表明这个蛋白直接影响它自身的表达。节律行为也有可能是基因表达调控的上游，这种可能也包括在了起始的模型中。考虑到与转录因子的同源性，Hardin的工作提出了一个更专一的假设：PER蛋白形成负反馈环影响其自身的表达，这个循环就是节律钟，或者至少是时间记录的中心。这个负反馈环是节律学家监测到的行为节律的上游。

值得注意的是，Paul的成功是受他所处的环境帮助的。他在我实验室很多的同事都研究酵母的RNA并且有领域最好的RNA研究方法。那时，PCR还没发明，Paul不得不用核酸酶保护来鉴定permRNA的水平。这个方法不是特别难但也不简单，布兰迪斯大学的节律研究工作，得益于其临近实际上是置于以核酸为中心的研究组。

这种新的基因表达反馈模型很有吸引力。而且这与蛋白聚糖假设似乎互斥。我强力督促他们去区分这两种可能性。我们后来的工作表明，GT重复区是不保守的，而且对PER的节律调控功能也不是必须的。Paul Hardin发现，负反馈调节机制依赖于per的5’端序列（主要发挥转录调节功能）。可能是因为当时对转录后调节不感兴趣，起码我们是这么假设的，这篇重要的文章发表时遇到挺多困难。这些困难构成了另外一个背景故事，这个以后再提及。一个研究生Xin Liu去了Seymour Benzer实验室利用免疫电镜技术发现PER是核蛋白。最后，另一个优秀的学生Hongkui Zeng（原文有错）揭示了PER的过表达导致perRNA水平低，与负反馈模型一致。

到1994年转录反馈环的假设已经很成熟。随后20年全世界在不同系统的工作整体支持真核生物节律系统中转录反馈环的工作。其中有些标志性工作值得提出。

节律研究的标志性工作

Young实验室利用正向遗传技术发现了第二个重要的节律基因，timeless。另外Takashi和其同事使用正向遗传技术克隆了哺乳动物节律基因Clock，与Weitz实验室合作鉴定了BMAL1基因。我实验室的Ravi Allada and Joan Rutila引领了节律系统的正调控因子的研究，成功地鉴定了果蝇Clock(哺乳动物Clock的同源蛋白CLK)和Cycle(BMAL1的同源蛋白CYC)的功能缺失突变体。这次筛选的副产物是，这些突变体被用来检测他们对period转录的影响。我们回补了很多无节律突变体，但只有3个对period的转录没影响，其中2个是CYC和CLK的等位基因。

Patrick Emery和Ralf Stanewsky合作克隆了果蝇的CRY基因并且揭示了其在光调控节律钟方面的作用，鉴定出一个功能缺失果蝇突变株。但直到现在，对CRY的工作机制和它如何与眼睛协同感知节律光的机制还不清楚。

节律调控并不只是在转录层面，有很多重要的研究发现转录后调控在节律计时上有重要作用。我认为，最开始和关键的系列研究来自于Young实验室，鉴定了果蝇的doubletime基因。它编码CKI激酶，是果蝇节律周期的关键调节子。它的同源蛋白在哺乳动物中发挥同样重要的作用。值得注意的是，PER是一个重要的节律底物，用来加强转录反馈环的关键作用。

尽管我们的研究是动物尤其是果蝇的节律调控，但这一转录-翻译节律调控在植物中也是逻辑一致的。不过，在原核光合生物比如蓝藻细菌中，节律钟的调控很不同。这个节律钟在最简单的形式下只需要三个基因，kaiA, kaiB, kaiC。Kondo及其同事发现在只需要3个重组蛋白kaiA, kaiB, kaiC和ATP就可以在体外重建节律钟。不需要转录就可以发挥作用，这个简单的体外节律钟甚至是温度补偿型的（节律周期本质上是温度不敏感的）。这一工作是标志性的，美妙的，有着重大突破的。

在真核世界，即便是15年后，在鉴定了这些蛋白的序列和对蓝藻节律钟大量机制的研究的基础上，也没能构造出类似于Kai系统的模式。所以看上去，蓝藻细菌和真核系统的节律调控有不同的起源，节律钟在进化上出现了多次。虽然3个不同的Kai基因在古细菌和原型细菌物种和所有蓝藻细菌系统，并且蓝藻细菌分子钟可以移植到大肠杆菌系统中，但这一最小节律模型却没在蓝藻外的其它物种中发现。一些蓝藻物种甚至突变解决了由于空间隔离而非时间隔离导致的固氮作用到氧问题的敏感性。这种与原核节律系统的不一致，表明真核的转录-翻译节律钟可能有更宽泛的进化影响。

节律研究的展望和对睡眠的研究

最近对PER-CLK转录为中心的动物模型的挑战是，代谢物尤其是一类过氧化物酶的过氧化在节律系统中的作用。一系列严格的实验表明这些节律在人的红细胞和果蝇、小鼠模型中独立于转录节律。重要的是，红细胞实验的关键部分可以被其它研究组独立重复出来。因为哺乳动物的红细胞缺少细胞核和转录，由此得出的这个重要假设很有可能是对的。然后，需要非常严格的条件来重复一类过氧化物酶的周期性，解释了为什么直接从动物体中获得红细胞没有这个节律性。重要的是，还没有实验室独立重复出关键节律蛋白失活突变的果蝇或小鼠中过氧化物酶的过氧化的周期性。这些惊人的结果表明这些节律独立于核心节律转录调节系统。尽管动物代谢节律是意料之中的，但是他们完全独立于核心节律机制和下游的行为机制是出人意料的。现在急需重复实验证明这一理论是对的。比如，睡-醒和食物消化节律在不限制喂食的动物中是时钟控制的；而代谢节律可能主要跟食物的摄入有关。到现在为止，还没看到能区分这两者的关键实验。代谢和一类过氧化物酶节律需要在全黑的环境下对快速和慢速的节律突变体进行评估才有意义。一类过氧化物酶节律真的独立于或者受到核心转录机制的影响还不得而知。

另外一个美中不足的是雄性求偶歌节律。转录反馈怎么能在1分钟的周期内调控节律？可能求偶歌节律确实反映的是PER的不依赖于转录的另一个功能。尽管，关于求偶歌节律的这种解释不无争议，但故事还在继续。

还有其他全景式的问题仍然需要解答。基因组的多大比例受到分子钟的控制？当前的估计是至少50%，会不会是100%，即所有的基因都受到节律钟的控制？

哺乳动物系统中的工作表明很多或者大部分甚至所有的细胞、组织都包含经典的节律钟。那么可能存在重要的特例，大脑是一个在节律领域还没有好好研究的组织。果蝇中，只有很少数目的神经细胞，在中脑两侧的大约75对细胞，中包含有功能的节律钟（染色判断节律蛋白的存在）。大部分果蝇的神经细胞是缺少已知的节律钟的，这里面一个特殊的是多巴胺系统。大部分哺乳动物这些神经细胞也缺少已知的节律基因的表达；哺乳动物的多巴胺系统可能也不表达节律基因。单细胞测序技术应该最终可以解决哺乳动物和果蝇中大脑神经细胞和节律钟的问题。

虽然发表了一些漂亮的工作尝试解决这一问题，但真核生物中温度补偿的普遍机理的解释仍是未来的一个重要方向。像前面提到的，节律周期是温度不敏感的。另外，我们现在也不知道节律时间系统控制中的限速步骤是什么。也就是说，什么决定了节律钟的步伐？是只有一个限速步骤还是有很多个，每个管理周期的不同部分？突变体在寻找调节步调或限速步骤的关键因子中是不靠谱的。我认为这两个问题（限速步骤和温度补偿）是相关的。每一个限速步骤都应该有温度补偿。我假设在一些水平没有温度补偿，比如转录和PER的聚集、TIM的加速方面，而随后随着温度升高的蛋白水平的代谢放缓。奇怪的是，这从来没有人测试过。

果蝇同时也是研究睡眠的有吸引力的模型。睡眠的目的和其调控是神经科学，也是生物科学的重要问题。哺乳动物中的经典研究表明睡眠是受到节律系统和更神秘的自我平衡调节系统调控的。前者反应的是体内的计时器，调节日常的睡意和警醒，而后者记录睡眠需求并对缺觉进行反应。我们最近的工作表明果蝇大脑中特殊的节律神经细胞通过抑制其它保持清醒的神经细胞来促进睡眠。这种节律神经细胞之间的互作是节律调控睡眠的重要特征。尽管这些研究并没有揭示自我平衡调节机制，果蝇在这一神秘的领域也在逐渐发挥作用。就像我们最开始在发育生物学研究中，随后在节律生物学研究中学到的，果蝇可能也会在哺乳动物的睡眠的功能和调节领域发挥领军作用。在最后，我认为基因表达调控也是在睡眠调节中的重要特征。