七夕特辑丨靶你放心上，42 分的 Nature 告诉你，如何修复一颗“受伤”心

又是一年七夕佳节，

萌 Cece 一直把您放在心上，

陪您一起过七夕~

说到“心肌再生”，你是不是又想到了两个词“心肌干细胞”，“学术造假”？不不不，此再生方法非彼再生方法，您且听 M 君细细道来。

M 君正经话：

来自美国德克萨斯大学西南医学中心的 Hesham A. Sadek 课题组在 Nature 上发表了题为 “A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes” 的文章，揭示了 Calcineurin-Hoxb13 轴调节哺乳动物心肌细胞生长。

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研究背景

1、心力衰竭影响全球 2600 多万人，心力衰竭的主要潜在原因是成年人心肌在受伤后无法自行修复。

2、哺乳动物的心脏在受伤后早期能够通过心肌细胞增殖实现再生。

■ 重要“人物” 介绍

Meis1：由 Meis1 基因表达。Meis1 是 TALE 家族中一种非 Hox 同源异型盒基因。Meis1 是细胞周期阻滞的关键调控因子，在胚胎心肌细胞发育中起重要作用。

Hoxb13：同源域转录因子，是前列腺上皮细胞分化的关键调节因子，与细胞周期的调控有关。

Calcineurin：钙调神经磷酸酶，细胞质中一种 Ca²⁺/CaM (钙调蛋白) 依赖性蛋白磷酸酶。当 Calcineurin 被钙激活时，通过其下游转录效应因子 NFAT (活化 T 细胞核因子) 介导肥厚反应，NFAT 直接被 Calcineurin 去磷酸化并发生核转位。

图 1. Calcineurin 在糖尿病动脉粥样硬化和心力衰竭中的作用通路^[7]

早在 2013 年，Hesham A. Sadek 研究团队在 Nature 发表的文章中，就将 Meis1 鉴定为心肌细胞增殖的关键转录调节因子，并认为它是心脏再生的潜在治疗靶标。

M  君叨叨：悄悄告诉你，研究背景不重要，重要的是今天朋友圈秀恩爱的暴击（溜了溜了……）

摘要

1、Hoxb13 是再生心肌细胞中再生关键因子 Meis1 的辅助因子。

2、成年小鼠心脏 Meis1 和 Hoxb13 双敲后促进心肌细胞有丝分裂，使肌节处于松散状态，改善心肌梗死后左心室收缩功能。

3、Meis1 和 Hoxb13 协同调节心肌细胞成熟和细胞周期。

4、Calcineurin 使 Hoxb13 在 Serine 204 位点 (Hoxb13^S204) 处去磷酸化，促进其核转运和细胞周期阻滞。

研究方法

■ 动物模型

条件性心肌细胞特异性 Hoxb13 基因敲除的 Hoxb13-KO 小鼠 (Myh6^cre : Hoxb13^fl/fl)；

Tamoxifen 诱导型心肌细胞特异性 Hoxb13 蛋白缺失的 Hoxb13-iKO 小鼠 (Myh6^mERcremER Hoxb13^fl/fl)；

心肌特异性 Myh6^cre : Meis1-Hoxb13 双敲除的 DKO 小鼠；

条件性诱导 Meis1 和 Hoxb13蛋白 缺失的 DiKO 小鼠。

■ 主要实验方法

免疫荧光染色；免疫印迹 (WB)；免疫共沉淀 (Co-IP)；染色质免疫共沉淀结合下一代测序 (ChIP-seq)；磁共振成像；经胸超声心动图检测；TUNEL 分析。

M 君叨叨：想知道 Meis1 如何作用，还需顺藤摸瓜！

实验结果

■ Hoxb13 与 Meis1 的关联

此前的研究中，Sadek 的研究团队已经发现 Hox 蛋白家族与 Meis1 有紧密联系。在这次的研究中，通过在心脏损伤后进行再修复的 7 天内 (P1-P7) 检测 Hoxb13 蛋白家族的表达发现，Hoxb13 是再生后心肌细胞中与 Meis1 相互作用的转录因子。

图 2. 再生后早期 Hoxb13 的表达与 Meis1 相关

【Postnatal day：再生后天数；

P1：Hyperplastic growth，增生性生长; 

P7：Hypertrophic growth，肥厚性生长】

M 君叨叨：确认过眼神，Hoxb13 和 Meis1 绝对有不可告人的关系，惹！

■ Hoxb13 的遗传缺失

首先，研究团队通过 Hoxb13-KO 小鼠发现，短时间内 Hoxb13 的缺失诱导心肌细胞增殖。另外，在注射 Tamoxifen 后，成年 Hoxb13-iKO 小鼠心脏 Hoxb13 蛋白减少，心肌细胞横截面积 (CSA) 显著减小，单核心肌细胞的比例也显著增加，而双核和多核心肌细胞的比例显著下降。两种小鼠实验结果表明，心肌细胞特异性 Hoxb13 缺失足以诱导成年小鼠心肌有丝分裂。

图 3. Hoxb13 缺失诱导小鼠心肌细胞有丝分裂和左心室射血分数 (LVEF) 的下降

除此之外，成年 Hoxb13-KO 小鼠中诱导了心肌梗死 (MI)，发现 Hoxb13 的敲除可以防止 LVEF 的下降，但是左心室收缩功能并没有改善。总的来说，Hoxb13 的缺失可预防 MI 后收缩功能的逐步恶化，但不会引起实质性功能恢复。

M 君叨叨：想知道 TA 有多重要，还得失去才知道 

■ Meis1 和 Hoxb13 蛋白共同缺失

Meis1-Hoxb13 的缺失，即 DKO 小鼠心脏中发现了心脏再生的一些特征，如心肌细胞肌小节分解，单核心肌细胞增加。并且观察到成年小鼠中心肌细胞的增殖也很活跃。他们再进行了进一步的研究，以评估 Meis1 和 Hoxb13 缺失对心肌肥大的影响，发现 DKO 心脏表现出运动诱发的生理性肥厚反应减弱。

图 4. DKO 小鼠心脏表现出

减弱运动诱发的生理性肥大反应

M 君叨叨：连 Meis1 和 Hoxb13 都携手而去了，让我看看谁还是左手牵右手？

■ DiKO 小鼠中的心脏再生

那么成年小鼠心脏中条件性诱导的 Meis1 和 Hoxb13 缺失是否能促进心肌细胞重新进入分裂周期呢？首先，观察发现 DiKO 小鼠的心脏体重比变大，注射 Tamoxifen 后，心肌细胞横截面积减少了约 30％，并且观察心肌细胞的数量与有丝分裂发现，Meis1-Hoxb13 特异性缺失会诱导成年小鼠心室心肌细胞增殖。

为了检测心肌细胞增殖水平增加是否有助于成年心脏的修复，对 DiKO 小鼠进行 MI 干预，结果表明，Meis1 和 Hoxb13 的缺失诱导心肌细胞增殖，可以改善 MI 后的左心室收缩功能。

图 5. DiKO 小鼠的左心室收缩功能改善

另外，Meis1 和 Hoxb13 的体内靶标鉴定发现了三组不同的基因：分别是同时靶标 Meis1 和 Hoxb13 的 272 个基因，1,647 个仅靶标 Meis1 的基因和 1,326 个仅靶标 Hoxb13 的基因。通路分析证明，Meis1  和 Hoxb13 协同调节心肌细胞的分化和细胞周期。

■ Calcineurin 调节 Hoxb13

蛋白免疫印迹 (WB)/免疫共沉淀 (Co-IP) 结果显示 (蛋白提取过程中别忘了使用蛋白酶和磷酸酶抑制剂来保护它们哟，戳一戳，MCE 官网直接可申请蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂 Cocktail 试用装哦！)，与 Meis1 和 Hoxb13 相似，P7 时钙调神经磷酸酶的催化亚基 CnA 的蛋白水平升高，并且这三种蛋白相互作用。扫描 Calcineurin 对接基序结果表明，Calcineurin 与 Hoxb13 直接相互作用，并可能将它去磷酸化。进一步地，他们找到了作用位点 S204，Calcineurin 依赖性的 Hoxb13^S204 去磷酸化作用促进了Hoxb13 的核转运，并促进了细胞周期的阻滞。

图 6. CnA 在 P7 天的表达量升高

■ Calcineurin 调控心肌细胞增殖

先前有报道表明，心肌细胞中 CnA 的过度表达会导致严重的病理性肥大。一致的，Sadek 研究团队也证明了强制表达激活的 Calcineurin 会导致心肌细胞增生过早转变为心肌细胞肥大，而抑制 Calcineurin 则延长了心肌细胞的增殖期。

图 7. CnA-Tg 心脏显示 LVEF 明显降低，

并伴有明显的疤痕

【CnA-Tg：Ppp3ca (编码 CnA) 基因持续活跃表达；Rcan1-Tg：Rcan1 (表达内源性 Calcineurin 抑制物) 基因持续活跃】

结论

研究确定了 Hoxb13 是心肌细胞分化和增殖的重要调节因子，证明了 Meis1 和 Hoxb13 协同调节心肌细胞成熟和细胞周期，并且发现了 Calcineurin 在调控中重要的作用，靶向 Calcineurin-Hoxb13 轴可能有助于治愈心脏损伤。

M 君叨叨：找到了靶点，靶向治疗还会远吗？

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Tamoxifen	口服有效的，选择性雌激素受体 (estrogen receptor) 调节剂 (SERM)。可诱导 Hoxb13 基因缺失。
Voclosporin	钙调神经磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) 抑制剂。
Fenvalerate	钙调神经磷酸酶 (Calcineurin; PP2B)  抑制剂，对 PP2B-Aα 的 IC50 为 2-4 nM。
Cyclosporin A	免疫抑制剂，能与亲环素结合，抑制钙调神经磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) 活性的 IC50 值为 7 nM。
Tacrolimus	大环内酯类，与 FK506 结合蛋白 (FKBP) 结合形成复合物并抑制钙调神经磷酸酶 (Calcineurin; PP2B) ，从而抑制 T 淋巴细胞信号转导和 IL-2 转录。具有强免疫抑制特性。
Tacrolimus monohydrate
Omecamtiv mecarbil	心脏特异性的肌球蛋白 (cardiac myosin) 激活剂。
Mavacamten	心肌肌球蛋白的调节剂，其在牛心脏和人心脏中的 IC50 值分别为 490，711 nM。
Danicamtiv	心脏肌动蛋白 (cardiac myosin) 的选择性变构活化剂。
Protease Inhibitor Cocktail	蛋白酶抑制剂 Cocktail 可以用于细胞或组织提取物用来增加蛋白稳定性。
Protease Inhibitor Cocktail,  mini-Tablet
Phosphatase Inhibitor  Cocktail I	磷酸酶抑制剂 Cocktail I/ II/ III 广谱性抑制酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTPs)，用于维持蛋白的磷酸化状态。
Phosphatase Inhibitor  Cocktail II
Phosphatase Inhibitor  Cocktail III

缩写：

TALE：Three amino acid loop extension
Meis1：Myeloid ecotrophic insertion site 1
NFAT：Nuclear factor of activated T cells
CSA：Cardiomyocyte cross-sectional area
MI：Myocardial infarction
LVEF：Left-ventricle ejection fraction

原文阅读：Ngoc Uyen Nhi Nguyen, et al. A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes. Nature. 2020 Jun; 582(7811): 271-276.
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参考文献 

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1. Ngoc Uyen Nhi Nguyen, et al. A calcineurin-Hoxb13 axis regulates growth mode of mammalian cardiomyocytes. Nature. 2020 Jun; 582(7811): 271-276.
2. Shalini A. Muralidhar, et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature volume 497, pages249–253(2013).
3. Satwat Hashmi, et al. Molecular switch model for cardiomyocyte proliferation. Cell Regen. 2019 Jun; 8(1): 12–20.
4. Jiqiang Yao, et al. The Homeobox gene, HOXB13, Regulates a Mitotic Protein-Kinase Interaction Network in Metastatic Prostate Cancers. Sci Rep. 2019 Jul 4; 9(1): 9715.
5. Hui-Bin Liu, et al. Calcineurin and electrical remodeling in pathologic cardiac hypertrophy. Trends Cardiovasc Med. 2010 Jul; 20(5): 148-53.
6. Benjamin J Wilkins, et al. Calcium-calcineurin signaling in the regulation of cardiac hypertrophy. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Oct 1; 322(4): 1178-91.
7. Manasi S Shah, et al. Molecular and Cellular Mechanisms of Cardiovascular Disorders in Diabetes. Circ Res. 2016 May 27; 118(11): 1808-29.

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