外泌体 (下)：癌症诊断和靶向治疗的“遍地开花”

上周，我们了解了外泌体的起源、生物合成、分泌和摄取的分子机制 (外泌体：“小废柴”到“大明星”的逆袭)，它的研究几乎涵盖了所有疾病领域。今天我们主要讲讲外泌体关于“恶之花”——癌症的相关应用。

据研究报道，很多癌细胞分泌的外泌体 (Exosome) 比正常细胞分泌的多 10 倍以上。外泌体参与了癌症的发生、进展、转移和耐药性，并通过转运蛋白和核酸，建立与肿瘤微环境的联系。例如，外泌体可导致免疫逃逸，癌细胞的免疫逃逸 (干货：免疫检查点) 是癌症发病机制中的一个重要问题。已有研究表明，外泌体可诱导 T 细胞的凋亡，调控功能性 T 细胞 (Treg)，诱导 M2 巨噬细胞的极化，抑制自然杀伤细胞 (NK) 的抗肿瘤毒性，抑制树突状细胞的 (DC) 分化为成熟 DC。此外，外泌体还可以保护癌细胞免受化疗药物的“毒性”作用，并将化疗耐药特性转移至“受体”细胞。如多药耐药相关蛋白 Pgp 被转移至药敏细胞，使药敏细胞也获得了耐药的能力。

图 1. 外泌体在维持癌症抗性中的主要作用

外泌体在疾病诊断和预后预测中的应用潜力

外泌体含有丰富的蛋白质，除了其来源细胞从头合成的蛋白，还包含其它细胞的蛋白，并具有以下特性，使其有希望成为用于癌症监测和功效评估的生物标记。

1、外泌体中与癌症相关的蛋白、脂质、mRNA、非编码 RNA、DNA 可用于检测癌症；

2、外泌体体积小，具有优越的穿过各种组织屏障的能力，比如血脑屏障、且广泛存在于各种体液中，便于获取和检测；和合成的纳米颗粒相比，外泌体具有更好的生物相容性和生物可降解性，因此具有低毒性和低免疫原性；外泌体在肿瘤细胞内的粘附性和内化性比同等大小的脂质体高 10 倍，表明外泌体对癌症的靶向性更高；

3、外泌体的脂质双分子层结构可有效保护其内容物不被血液循环中的酶降解。有研究报道，冷冻 5 年的外泌体中仍然可以分离出完好的磷酸化蛋白；

4、血液中的成分很复杂，癌细胞分泌的特定蛋白等生物分子在血液中被稀释，因此在早期阶段或其含量较低时，不容易被检测到，但外泌体有膜包裹，且可被完整分离出来，其携带的分子不会被稀释；

5、外泌体和与肿瘤靶向蛋白、多肽或抗体一起进行基因工程编辑，用于更佳精准的治疗药物的递送。

据统计，每毫升血液中含有超一亿个外泌体，其数量和组成特性有利于早期癌症的诊断。以肺癌为例、血小板来源的外泌体已被证明可促进癌细胞的生长和转移。肾细胞来源的外泌体可促进肺癌合并腹水患者血管的生成。2015 年，J Extracell Vesicles (IF=14.976) 报道了一项非小细胞肺癌 (NSCLC) 相关研究，该研究共纳入 109 位 IIIa-IV 期 NSCLC 患者及 110 位对照人群的血液样本数据，研究发现，在这些晚期 NSCLC 患者体内，CD317 和 EGFR 在外泌体表面丰量表达。2016 年，J Thorac Oncol (IF=13.357) 报道的一项临床研究共纳入 581 例 (431 位 NSCLC 患者以及 150 个对照群体) 血液组织样本，研究发现，和对照组相比，患者体内的 CD171，CD151 和 Tetraspanin 8 蛋白显著高表达，在鳞状细胞癌和小细胞肺癌患者中，CD151 也是独立的生物标志物。这些分子都有望成为早期肺癌检测的生物标志物。

图 2. 外泌体标记物^[11]

外泌体中非编码 RNA 的研究也越来越火热，例如转移性胃癌细胞系 AZ-P7a 通过外泌体释放 let-7 miRNA (肿瘤抑制 miRNA) 进入细胞外环境中，从而维持肿瘤发生进程。外泌体来源的 miR-198、miR-26a、miR-34a 和 miR-494 在 MCF-7 乳腺癌细胞系中丰量表达，而 miR-130a、miR-328–5p 和 miR-149-3p 在 MDA-MB-231 乳腺癌细胞系中表达量很高。这些 miRNA 都有潜力成为乳腺癌诊断的生物标记分子。

外泌体在癌症治疗领域的应用潜力

图 3. 外泌体提高靶向性的应用方法^[9]

■ 药物载体

实例一：促进 KRAS 突变的胰腺癌靶向治疗——通过基因工程的方法，在外泌体中转入靶向 KRAS^G12D 的 siRNA 或 shRNA (称为 iExosome)，在多种胰腺癌模型中表现出良好的疗效。经 iExosome 治疗的胰腺癌小鼠，其肿瘤生长明显抑制，且 iExosome 不影响原位 BxPc-3 KRAS^WT 肿瘤的生长。和传统的 RNAi 药物载体脂质体相比，iExosome 更加高效，一方面，因为外泌体作为纳米级的囊泡，更加自如轻松的在体内循环作用靶细胞；另一方面，要归功于 CD47 介导的保护作用使外泌体免受单核细胞和巨噬细胞的吞噬，从而到达靶向部位。

实例二：修饰外泌体表面提高靶向性——来自人胚肾细胞 (HEK293) 的外泌体含有 GE11 肽和 let-7a，GE11 可与 EGFR 受体结合。使用近红外染料 DiR 标记外泌体， 并通过体内成像系统和体外检测外泌体迁移过程发现，到达肿瘤细胞的外泌体中，含有 GE11 的外泌体是对照组的 3 倍。且注射组小鼠在组织学上未发现明显损伤。

此外，和对照组 (注射对照 miRNA 的外泌体) 相比，含有 let-7a 的 GE11 阳性外泌体显著抑制了肿瘤的生长 (let-7a 是一个肿瘤抑制 miRNA, 通过下调 HMGA2 或 RAS 家族成员，如 K-Ras、H-Ras 和 N-Ras 的表达来抑制肿瘤的发展)。表明了，GE11 阳性外泌体可促进体内治疗分子 (如 let-7a) 向表达 EGFR 的肿瘤细胞传递。

实例三：基因工程改造内容物——研究显示，利用来自小鼠未成熟的树突状细胞产生外泌体 (低毒性)，通过基因改造使其表达外泌体膜蛋白 Lamp2b 并融合 αv 整合素-特异性 iRGD 多肽，而表达 iRGD 的外泌体在体外可高效靶向 αv 整合素阳性的肿瘤细胞并特异性的递送 Dox (Doxorubicin) 至肿瘤组织，有效抑制癌细胞生长并无明显毒性，揭示了基因工程改造内容物具有巨大的临床潜力。

图 4. 外泌体治疗的策略^[11]

■ 利用外泌体研制抗肿瘤疫苗

肿瘤来源的外泌体 (Tumor-derived exosomes, TEX) 对免疫系统具有双重作用，即免疫抑制或免疫刺激作用。TEX 能干扰树突状细胞 (DCs) 的成熟，减弱 NK 细胞的活化作用，将巨噬细胞转化为促肿瘤表型。在黑色素瘤小鼠模型实验中，接受装载有半乳糖神经酰胺/卵蛋白外泌体治疗的小鼠，表现出早期的 T 细胞反应及肿瘤生长抑制。来自多发性骨髓瘤 (MM) 细胞的外泌体被用于刺激 MM 细胞系的抗肿瘤免疫反应和预防性免疫。患者血清中富集的 TEXs 可能为 DCs 疫苗接种提供一个优化的、个体特异性的抗原来源。如何充分利用 TEXs 的优势，扬长避短，调节肿瘤免疫，还需要进一步研究。

外泌体的研究与日俱增，但是其合成、分泌和摄取的分子机制仍然有很多未知，还需要大量的科学研究，为更好的应用提供坚实的基础。

期待更多的外泌体突破研究花落“你”家哦！

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外泌体化合物库

收录了 30+ 种具有激活或抑制外泌体分泌的化合物，是外泌体研究的有用工具。

GW4869

非竞争性的中性鞘磷脂酶 (N-SMase) 抑制剂，IC₅₀ 值为 1 μM；是外泌体合成/释放的抑制剂。

Lansoprazole

质子泵抑制剂，能抑制胃酸生成；是中性鞘磷脂酶 (N-SMase) 的抑制剂 (外泌体抑制剂)。

Tipifarnib

法尼基转移酶 (FTase) 抑制剂，IC₅₀ 为 0.86 nM；具有潜在抗肿瘤活性；是外泌体 (exosome) 生成和/或分泌的有效抑制剂。

U-104

有效的碳酸酐酶 (CA) 抑制剂；有效的外泌体 (exosome) 抑制剂，EC₅₀ 为 0.2 μM。

Tunicamycin

同源核苷抗生素的混合物, 可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)；还能引起细胞内质网 (ER) 中未折叠蛋白的积累并诱导 ER 应激；能促进宫颈癌细胞中外泌体的释放。

Forskolin

腺苷酸环化酶 (Adenylate cyclase) 激活剂；也是一种细胞内 cAMP 形成的诱导剂；还是有效的外泌体生物发生和/或分泌激动剂。

精彩往期

参考文献 

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1. Weihua Li, et al. Role of exosomal proteins in cancer diagnosis. Mol Cancer. 2017 Aug 29; 16(1): 145.
2. Kristine R Jakobsen, et al. Exosomal proteins as potential diagnostic markers in advanced non-small cell lung carcinoma. J Extracell Vesicles. 2015 Mar 2; 4: 26659. 
3. Birgitte Sandfeld-Paulsen, et al. Exosomal Proteins as Diagnostic Biomarkers in Lung Cancer. J Thorac Oncol. 2016 Oct; 11(10): 1701-10. 
4. Yunjie He, et al. Exosomal microRNA: a novel biomarker for breast cancer. Biomark Med. 2018 Feb; 12(2): 177-188. 
5. Katie E Gilligan, et al. Engineering Exosomes for Cancer Therapy. Int J Mol Sci. 2017 May 24; 18(6): 1122. 

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8. Shin-ichiro Ohno, et al. Systemically injected exosomes targeted to EGFR deliver antitumor microRNA to breast cancer cells. Mol Ther. 2013 Jan; 21(1): 185-91. 
9. Jinheng Wang, et al. Exosome-Based Cancer Therapy: Implication for Targeting Cancer Stem Cells. Front Pharmacol. 2017 Jan 12; 7: 533.
10. Yanhua Tian, et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 2014 Feb; 35(7): 2383-90. 
11. Jie Dai, et al. Exosomes: key players in cancer and potential therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 2020 Aug 5; 5(1): 145. 

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