PROTAC——模块化构建药物分子的未来

许多传统小分子药物竞争性结合靶蛋白与底物的结合位点，“鸠占鹊巢”式发挥抑制 (或激动) 作用，如：非甾体抗炎药对乙酰氨基酚、降脂药物辛伐他汀以及众多替尼类抗癌药物等。

但仍然有 80% 的蛋白靶点不能用这样简单的逻辑开发成药，原因复杂多样，比如：蛋白本身缺乏相应结合腔、蛋白存在于细胞内部药物无法抵达、内源性底物本身高亲和力及浓度、蛋白的致病机制不依靠催化活性或蛋白间相互作用等等。

这里一个很好的例子就是 KRas，直到 Shokat 等首次在 Nature 上报道了 K-Ras (G12C) 抑制剂，对 KRAS-G12C 突变体二号口袋进行不可逆共价结合，最终带来如今的 AMG-510 (详见前文：不可成药靶点” KRAS: 关门才是大吉)。

诚然，共价抑制剂是对抗众多不可成药靶点的一大出路，但安全性与生物活性评价等问题还有待解决。相比之下，另一种药物设计思路既能解决大部分靶点不可成药的问题，又兼具传统小分子药物的诸多优点，那就是 PROTAC 技术。

PROTAC VS. 传统小分子

PROTAC 全称为 proteolysis-targeting chimeras (蛋白水解靶向嵌合分子)，是一种杂合双功能小分子化合物，由三部分组成：靶蛋白配体、连接子 Linker、和 E3 连接酶配体，结构中两个配体之间通过 linker 相连，从而形成“三体”聚合物——靶蛋白配体-Linker-E3 配体。它通过将目标靶蛋白和细胞内的 E3 泛素连接酶的距离拉近，利用泛素-蛋白酶体途径特异性的降解靶蛋白。

PROTAC 对蛋白的降解是事件驱动机制，它的两端能分别连接相应的配体与 E3 连接酶，所以在浓度上存在一个最佳活性浓度，在此浓度两边由于 PROTAC 与蛋白的结合产生的过量或不足的游离蛋白都会导致降解效能的下降。

图 1. PROTAC 分子的机制^[3]

PROTAC 分子在进入细胞后，目标蛋白配体可特异性地与相应的靶蛋白结合，另一端可募集 E3 连接酶，从而形成“三体”聚合物；E3 连接酶可介导泛素结合酶 E2 对目标蛋白配体泛素化。被泛素标记的目标蛋白可被蛋白酶体识别并降解。 

传统小分子需要知晓靶蛋白的内在作用位点和机制，而 PROTAC 则不用重视靶蛋白本身机制，无需竞争性位点，只要结合上，直接将靶蛋白泛素化标记后降解。此外，由于它的机制特殊，仅需少量就可发挥药效，用量常常是纳摩尔级别，也正因为如此，它在安全性和活性评价方面需要特殊的方法。

最后，常规 PROTAC 药物也存在溶解性和透膜性等问题。下图是两者优缺点的详细比较。

图 2. PROTAC 与传统小分子优缺点对照图

■ E3 连接酶配体

E3 连接酶可以分成 RING、HECT、RBR 等家族，每个家族下又有其他分型。目前已知的 E3连接酶约有 600 多种，但在 PROTAC 中常用配体的相关 E3 连接酶只有 CRBN、VHL、IAP、MDM2 等四种，此外还有 DCF15、RNF114、DCAF16、KEAP1、FEM1B 等仅有少数配体报导的E3连接酶。下图是常见的 E3 连接酶配体及其案例。

图 3. 常见的 E3 连接酶及其配体^[6]  

■ 靶蛋白配体

泛素-蛋白酶体途径可以针对细胞周期蛋白、纺锤体相关蛋白、细胞表面受体、转录因子、肿瘤抑制因子、癌基因产物以及应激条件下胞内变性蛋白及异常蛋白等靶蛋白进行降解。而目前对 PROTAC 配体的选择上大部分还只是基于已知的抑制剂/激动剂，靶点也多为癌症相关蛋白。这表明对 PROTAC 的研究还处在早期阶段，靶蛋白配体可以采用虚拟筛选与高通量筛选的方法不考虑竞争结合，而神经退行性疾病、自免性疾病等相关蛋白也有待开发。

2021 年，Nature Reviews Drug Discovery 杂志报导了一篇利用 PROTACtability 方法评价蛋白靶点的可 PROTAC 性的文章，文章最后值得 PROTAC 化的靶点包括了激酶 (MEK、KRAS、CDK 和 Bcr/Abl)、转录因子 (如 p53、STAT、RAR、ER 和 AR)、表观遗传因子 (如 HDAC 和 BET 溴结构域)和 E3 连接酶本身 (如 MDM2) 等。

图 4. PROTACability 靶点评价^[7]

 ■ 连接子 Linker

Linker 是连接 E3 连接酶配体与靶蛋白配体的连接单元。链长是 Linker 最重要的参数，链长过短会因空间碰撞而阻碍三元配合物形成，链长过长则会带来结合熵增加。

常见的 Linker 为 PEG 或者直链烷烃等，连接常用酯化、酰胺化、Click 反应等构建。PROTAC 分子的后期改造则是在此基础上，通过改变链长、引入芳基增加疏水性及刚性、增加一条连接链限制分子扭转、利用光转换基团事先屏蔽活性位点等方法来提高分子的总体性能。不同的连接子基元也有相应的特点，如下图所示：

图 5. Linker 的不同基元及优缺点^[10]

除了上述 Linker 分子，也有研究者将 Linker 设计成可以连接两个靶蛋白配体的结构，其中关键在于中间三功能氨基酸 (苏氨酸、丝氨酸等) 的引入。如在Rational Design and Synthesis of Novel Dual PROTACs for Simultaneous Degradation of EGFR and PARP 一文中，研究者将 EGFR 配体、PARP 配体和 E3 连接酶通过常见的烷基链与中间的枢纽氨基酸相连，并在体外活性测试中验证了该分子具有 EGFR 与 PARP 的双重降解活性。

图 6. 双功能分子 PROTAC^[10]

总结与展望

PROTAC 技术目前发展的如火如荼，它能一力降十般解决许多靶蛋白不成药的问题，但是溶解性、透膜性和选择性等问题的存在又使它的开发过程如履薄冰。解决这些问题可能需要新的 E3 连接酶配体的发现，也可能需要 Linker 分子基元的创新，恰逢这个时代，这些既是机遇也是挑战。

而在 PROTAC 之外，还有许多类似的技术，比如降解膜蛋白和胞吞蛋白的 LYTAC (详见干货丨药界新宠—— LYTAC 与靶向蛋白降解技术)、AUTAC、ATTEC 等，利用同样的泛素-蛋白酶体途径降解 IKZF 蛋白的“分子胶” (详见干货丨分子胶：改变蛋白-蛋白关系的时空开关)等，基于抗体偶联药物技术将 PROTAC 连在抗体上的 PAC 药物等，也为 PROTAC 技术的发展提供了新的开发方向。

无论前方如何，路总是人走出来的，更何况可以模块化构建的 PROTAC 分子，小分子作为药物领域的一大前沿技术，大大缩短了小分子药物的发现与设计周期。

■ MCE 可提供的产品与服务

MCE 是全球领先的科研化学品和生物活性化合物供应商，我们配备强大的技术人才团队和国际先进的设备，对于 PROTAC 产品，我们拥有丰富的研发和生产经验。

MCE 可以为科学家提供 PROTAC 相关模块化产品，目前我们已有 3200+ PROTAC 相关产品在线，并且在持续增加中。

同时，MCE 不断突破创新，还可以提供 PROTAC 相关产品定制化服务，可以根据客户要求合成不同类型的 PROTAC 产品 (可从客户需要的靶蛋白进行从初期配体筛选直到最终 PROTAC 分子设计合成)，并确保产品的有效性与一致性，始终保证优质高效的服务品质。此外，对所有的定制产品，我们都会提供其结构表征、理化性质和药物杂质等信息。

E3 ligase ligand linker conjugate

N-Descyclopropanecarbaldehyde Olaparib

N-Descyclopropanecarbaldehyde Olaparib 是含有 DOTA 的奥拉帕尼的类似物，可用于合成新型靶向 EGFR 和 PARP 的双靶点 PROTAC，DP-C-4。

Pomalidomide 4'-alkylC5-acid

是一种合成的 E3 连接酶配体-Linker 偶联物，包含基于 Pomalidomide 的 Cereblon 配体和 1个 Linker。

Target protein ligand linker conjugate

FAK ligand-Linker Conjugate 1

包含靶蛋白 FAK 配体和 PROTAC linker，可募集 E3 连接酶 (如 VHL，CRBN，MDM2 和 IAP 等类型)。FAK ligand-Linker Conjugate 1 可广泛用于 PROTAC 介导的蛋白降解。

K-Ras ligand-Linker Conjugate 4

包含靶蛋白 K-Ras 配体和 PROTAC linker，可募集E3连接酶 (如VHL，CRBN，MDM2 和 IAP 等类型)；可用于合成 PROTAC K-Ras Degrader-1 (HY-129523)。

PROTAC

dBET6

不可逆的选择性 BTK 抑制剂，用于合成一系列 PROTAC 分子，如 P13I。

PROTAC K-Ras Degrader-1

是一种基于 PROTAC 技术的有效的 K-Ras 降解剂，在 SW1573 中对 K-Ras 降解率 ≥70%。

SNIPER

SNIPER(ABL)-020

由 Dasatinib (ABL 抑制剂) 通过 Linker 与 Bestatin (cIAP1 配体)组合而成，可有效降解 BCR-ABL 蛋白。

PROTAC-linker Conjugate for PAC

PROTAC BRD4 Degrader-5-CO-PEG3-N3

是一种用于 PAC 的 PROTAC-linker 偶联物，包含 BRD4 降解剂 GNE-987 和 3 个 PEG 的 Linker。

PROTAC BRD4 degrader for PAC-1

是一种用于 PAC 的 PROTAC-linker 偶联物，包含嵌合体 BET 降解剂 GNE-987 和含二硫化物的 Linker。

 MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务。

参考文献

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1. Ostrem JM, Peters U, Sos ML, Wells JA, Shokat KM. K-Ras(G12C) inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions. Nature. 2013 Nov 28;503(7477):548-51.2. News: Arvinas and Pfizer Announce Global Collaboration to Develop and Commercialize PROTAC® Protein Degrader ARV-471. 3. Zou Y, Ma D, Wang Y. The PROTAC technology in drug development. Cell Biochem Funct. 2019 Jan;37(1):21-30.4. Pettersson M, Crews CM. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) - Past, present and future. Drug Discov Today Technol. 2019 Apr;31:15-27.5. Dale B, Cheng M, Park KS, Kaniskan HÜ, Xiong Y, Jin J. Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2021 Jun 15;1-17.6. Schneider M, Radoux CJ, Hercules A, Ochoa D, Dunham I, Zalmas LP, Hessler G, Ruf S, Shanmugasundaram V, Hann MM, Thomas PJ, Queisser MA, Benowitz AB, Brown K, Leach AR. The PROTACtable genome. Nat Rev Drug Discov. 2021 Jul 20.7. Morreale FE, Walden H. Types of Ubiquitin Ligases. Cell. 2016 Mar  24; 165(1): 248-248.e1.8. Bricelj A, Steinebach C, Kuchta R, Gütschow M, Sosič I. E3 Ligase Ligands in Successful PROTACs: An Overview of Syntheses and Linker Attachment Points. Front Chem. 2021 Jul 5;9:707317.9. Bemis TA, La Clair JJ, Burkart MD. Unraveling the Role of Linker Design in Proteolysis Targeting Chimeras. J Med Chem. 2021 Jun 24;64(12):8042-8052.10. Troup RI, Fallan C, Baud MGJ. Current strategies for the design of PROTAC linkers: a critical review. Explor Target Antitumor Ther. 2020;1:273-312.

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