你造吗？ 氧气是有毒的，需氧生物能在氧气存在下生存，全靠它们具有抗氧化防御能力！惊不惊喜，刺不刺激，是不是谢天谢地自己又活了一天？ 嘻嘻，不扯不扯，咱们今天教大家 ROS 检测！
【定义】: 活性氧 (Reactive oxygen species, ROS)，细胞正常代谢的副产物，氧的部分还原代谢产物，是源自 O2 且比 O2 本身更活泼的物质的统称[1][2]。【组成】: ROS 不仅包括超氧自由基阴离子 (O2•−) 和一些其他氧自由基，还包括一些 O2 的非自由基衍生物，如过氧化氢 (H2O2)、次氯酸 (HOCl) 和过氧亚硝酸盐/过氧亚硝酸 (ONOO−/ONOOH)。【来源】: ROS 主要在线粒体中产生，除细胞代谢外，ROS 还由特定的质膜氧化酶在生长因子和细胞因子的作用下产生，同时也可通过外部因素（如环境应激、辐射、药物等）引起增加。
图 1. 活性氧的潜在来源[3]。
许多酶，包括线粒体电子传递链中的酶、黄嘌呤氧化酶、环氧化酶、脂氧化酶、髓过氧化物酶、细胞色素 P450 单加氧酶、解偶联 NOS、血红素加氧酶、过氧化物酶和 NAD(P)H 氧化酶，都能产生 ROS。根据它们在细胞中的位置，这些 ROS 可以在细胞内、细胞外或特定的细胞内区室中产生。
ROS 具有强氧化能力，低浓度时发挥复杂的信号传导功能，但在高浓度时对细胞有害。
【氧化应激】细胞具有一套防御系统来将 ROS 维持在生理正常水平，即酶促抗氧化剂，负责将自由基转化为稳定的、危害较小的分子。但当细胞产生的 ROS 超过其抗氧化能力时，可能会对细胞大分子（如脂质、蛋白质和 DNA）造成损害，导致氧化应激状态。
这种损伤被认为与许多疾病的发展和老化过程相关，包括肺动脉高压、心肌病、糖尿病、帕金森病和癌症等。
举个栗子：
氧化应激在癌症特征 (如血管生成、侵袭性、干细胞和转移能力) 中起着重要作用：癌细胞是代谢活跃且缺氧的细胞，由于大量生长和血管灌注不足，往往会产生更多的 ROS，ROS 通过线粒体膜扩散损伤 DNA，同时还充当信号转导信使，参与细胞存活、治疗耐药性等。
图 2. 正常细胞和癌细胞中 ROS 信号传导的概述[4]。
【抗氧化剂】生物学中存在多种抗氧化剂。体内的主要抗氧化剂是酶系统，例如，超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD) 将 O2- 转化为 H2O2、过氧化氢酶作用于 H2O2 产生 H2O 和 O2、谷胱甘肽过氧化物酶分解 H2O2 和 LOOH 等。此外，还有常用作“抗氧化剂”的低分子量化合物如 N-acetylcysteine (NAC) 等。
目前针对 ROS 的检测方法主要有荧光染色法、电子顺磁 (自旋) 共振技术(Electron paramagnetic (spin) resonance, EPR/ESR)、化学发光法、色谱法、分光光度法、电化学生物传感器和基于荧光蛋白等。
表 1. 检测/定量活性氧的方法 (不同环境)[5]。▐ 特定 ROS 检测方法
检测试剂：HKSOX-1，HKSOX-1r，HKSOX-1m超氧阴离子自由基 (O2•-) 一直被认为是一种重要的细胞信号分子，参与先天免疫和代谢稳态等多种生理和病理过程。O2•- 的异常产生可导致铁硫 (Fe-S) 蛋白和半胱氨酸硫醇等生物分子的氧化损伤，或直接诱导细菌和哺乳动物细胞死亡。其二次产物，如过氧化氢 (H2O2)、羟基自由基 (OH)、过氧亚硝酸盐 (ONOO-) 和次氯酸(HOCI)，也参与信号转导和多种病理状况。
图 3. 使用 HKSOX-1 对受精后 72 h 斑马鱼胚胎内源性 O2•−共聚焦成像[6]。
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检测试剂：HKPerox-1，HKPerox-2
H2O2 主要由 NADPH 氧化酶与超氧化物歧化酶、线粒体电子传递链和许多其他酶共同产生，是一种强双电子氧化剂，但其高活化能限制了其对少数生物靶标的反应性。H2O2 相对稳定。它与谷胱甘肽、半胱氨酸和蛋氨酸的反应非常缓慢，但根据特定的蛋白质结构和环境，其对特定蛋白质中半胱氨酸的反应活性可大大提高到 10 M-1S-1 (约为蛋白质中平均半胱氨酸的 106 倍)，为 H2O2 在氧化还原信号中的选择性和特异性提供了基础。它们在细胞信号传导中起作用，特别是在免疫系统中，并通过铁下垂参与细胞死亡。
图 4. 利用 HKPerox 探针在活细胞中进行内源性 H2O2 的分子成像[6]。RAW264.7 巨噬细胞与 HKPerox-1 (10 mm) 和 CCl3CN 共培养的代表性共聚焦图像。
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检测试剂：HKPerox-1，HKPerox-2
在所有活性氧 ROS 中，•OH 被认为是最具活性和最有害的一种。它的寿命很短，大约 10-9 秒，可以与许多生物分子如 DNA 碱基、脂质和蛋白质以扩散控制的速率发生反应，它的过量产生会导致细胞损伤，并与多种疾病有关。另一方面，越来越多的证据表明，“•OH”和其他 ROS 的产生可以应用于癌症治疗。因此，监测细胞内•OH 对于了解其生物学影响和进一步研究其治疗用途至关重要。
图 5. 共聚焦成像中 HKOH-1r 对 RAW264.7 小鼠巨噬细胞内源性 •OH 的检测[8]。
高灵敏度、高选择性的羟基自由基检测探针已经被开发出来。荧光探针 HKOH-1 已被应用于几种羟基自由基清除剂的抗氧化能力筛选。通过共聚焦成像和流式细胞术，HKOH-1r 检测了多种细胞类型中内源性羟基自由基的产生。
检测试剂：HKOCl-3，HKOCl-4，HKOCl-4m
次氯酸和次氯酸盐是细胞内重要的 ROS 之一，它由 H2O2 和 Cl- 通过髓过氧化物酶催化，HOCl 可以作为免疫防御系统破坏侵入性细菌，而另一方面，由于致病性氧化应激损伤，它可以引起包括癌症在内的许多疾病。
图 6. 内源性 HOCl 与 HKOCl-4r 在 RAW264.7 小鼠巨噬细胞中的共聚焦荧光成像[9]。
检测试剂：HKYellow-AM (6/12-mixture)、 HKGreen-4I
氧化自由基包括活性氧 (ROS) 和活性氮 (RNS) 在脑 I/R 损伤的病理过程中起着至关重要的作用。在脑缺血再灌注阶段，同时产生的一氧化氮 (NO) 和超氧阴离子(O2•-) 以扩散速率迅速形成过氧亚硝酸盐 (ONOO-)。ONOO- 可以穿透生物膜，甚至具有比 O2•- 更高的扩散能力。ONOO- 通过触发一系列分子级联反应，在介导凋亡细胞死亡、炎症、梗死扩大和血脑屏障破坏中发挥关键作用。
图 7. 内源性 ONOO- 与 HKYellow-AM 在 SH-SY5Y 细胞中的共聚焦荧光成像[10]。
[1] Thannickal VJ, et al. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 Dec;279(6):L1005-28. [2] Arfin S,et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021 Apr 22;10(5):642. [3] Griendling KK, et al. Oxidative stress and cardiovascular injury: Part I: basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS. Circulation. 2003 Oct 21;108(16):1912-6. [4] Khan AQ, et al. Reactive oxygen species (ROS) in cancer pathogenesis and therapy: An update on the role of ROS in anticancer action of benzophenanthridine alkaloids. Biomed Pharmacother. 2021 Nov;143:112142. [5] Murphy MP, et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 2022 Jun;4(6):651-662. [6] Hu JJ, et al. Fluorescent Probe HKSOX-1 for Imaging and Detection of Endogenous Superoxide in Live Cells and In Vivo. J Am Chem Soc. 2015 Jun 3;137(21):6837-43.[7] Ye S,et al. Tandem Payne/Dakin Reaction: A New Strategy for Hydrogen Peroxide Detection and Molecular Imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 2018 Aug 6;57(32):10173-10177. [8] Bai X, et al. HKOH-1: A Highly Sensitive and Selective Fluorescent Probe for Detecting Endogenous Hydroxyl Radicals in Living Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 2017 Oct 9;56(42):12873-12877. [9] Xiaoyu Bai, et al. HKOCl-4: a rhodol-based yellow fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid in living cells and tissues. Organic Chemistry_Frontiers. Issue 8, 2020.[10] Feng J,et al. Naringin Attenuates Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury Through Inhibiting Peroxynitrite-Mediated Mitophagy Activation. Mol Neurobiol. 2018 Dec;55(12):9029-9042.