武汉大学药学院刘天罡教授团队：调整聚酮骨架的表达提升异源多杀菌素的合成 | SSB
武汉大学药学院刘天罡教授团队，近期在Synthetic and Systems Biotechnology期刊发表名为“Increasing the heterologous production of spinosad in Streptomyces albus J1074 by regulating biosynthesis of its polyketide skeleton：调整聚酮骨架的表达提升异源多杀菌素的合成”的文章。该文章在该实验室前期异源合成多杀菌素工作的基础上就如何进一步提升多杀菌素的产量展开持续探索，并且取得了新的研究进展。武汉大学博士研究生安子恒和陶慧博士为文章的共同第一作者，刘天罡教授与中国科学院深圳先进技术研究院刘然副研究员为共同通讯作者。
多杀菌素是一种广谱低毒高效的杀虫剂，由刺糖多胞菌（Saccharopolyspora spinosa）经有氧发酵产生。然而由于该菌株的发酵周期过长，分子改造困难等一系列因素制约了多杀菌素在天然产生菌种的遗传改造工作。在这篇文章中，作者在实验室前期工作的基础上，尝试在异源链霉菌底盘中对多杀菌素的产量进行进一步提升。
图1：多杀菌素的生物合成途径
本篇文章的工作重点首先集中在了多杀菌素的聚酮合酶的过表达上，多杀菌素的原始生物合成基因簇（BGC）包含十个操纵子，聚酮合酶基因（spnA、B、C、D、E）由其中的两个操纵子控制。其中spnA、B和C由位于spnA之前的一个启动子共同表达，spnD和E由位于spnD之前的启动子共同表达。在本篇工作之前，刘天罡课题组通过在spnD和spnE之间插入一个强组成启动子(kasOp*)，使聚酮合酶SpnE进行高表达，将异源多杀菌素产量从686 μg/L提高到1460 μg/L（菌株名为OE3）【1】，该结果证明了这种改造策略的潜力。在本篇工作中，作者尝试利用强启动子来控制每个PKS基因的表达，首先将spnA，B，C前面的启动子替换为rpsLp-cf（菌株命名为AE，即在过表达spnE的OE3菌株基础上过表达spnA，以下命名策略相同）。与OE3相比，AE的产量达到了30.26 mg/L，提升了近11倍。随后又在AE的基础上将spnD前的启动子替换为rpsLP-tp（ADE），产量进一步提升达到了36.68 mg/L，该结果充分说明了该策略的可行性。
图2：关于PKS基因的相关设计策略
随后，作者又尝试使用不同强度的启动子分别对spnABC操纵子中的单个基因分别进行过表达，将ADE菌株在spnC和spnB基因前插入kasOp*和kasOp*-rpsLP-cf，分别构建菌株ACDE和ABDE，但是多杀菌素的产量反而下降。该结果说明，spnABC操纵子被破坏时，spnB和spnC的过表达可能对多杀菌素的合成有害。同时还可以看出与ABDE相比，ACDE的产量降低较小，所以推测spnA和spnBC的平衡表达可能比spnAB和spnC的平衡表达更重要。为了证明这一点，作者在ADCE和AE上分别过表达了spnB（ABCDE和ABE），结果显示发酵产量仍然是下降的。这个结果进一步证实了spnABC操纵子的破坏不利于多杀菌素的合成，spnA和spnBC的分开过表达会导致多杀菌素的产量降低。
聚酮化合物前体的供应也被认为是高产的一个重要因素，聚酮化合物生物合成的第一步一般涉及酰基辅酶A羧化酶，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和丙酰辅酶A羧化酶(PCC)分别催化产生丙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A，这两个物质均为多杀菌素合成的前体。作者通过在菌株ADE的基础上过表达ACC、PCC和AcsA（图3A），构建了菌株ADE-AP，其发酵产量达到了59.59 mg/L，相较于ADE提升了62.46％。为了进一步证明该策略的可行性，作者针对ADE和ADE-AP发酵液进行了相关辅酶A浓度的测定。结果显示，ADE中丙酰辅酶A的浓度是ADE- AP的6.8倍，而ADE中甲基丙二酰辅酶A的浓度低于ADE- AP，说明PCC过表达导致更多丙酰辅酶A转化为甲基丙二酰辅酶A。此外，ADE- AP中乙酰辅酶A的浓度是ADE的1.3倍，表明过表达AcsA也是有作用的。作者观察到ADE和ADE- AP的丙二酰辅酶A浓度没有差异，但多杀菌素产量却有所增加，说明ADE- AP将更多的丙二酰辅酶A来合成多杀菌素，因此，ACC的过表达增加了可用于多杀菌素合成的丙二酰辅酶A的丰度。总的来说，这些结果表明靶向性的增加多杀菌素前体能够导致多杀菌素的高效生产。
图3：（A）多杀菌素前体合成途径；（B）过表达ACC，PCC后辅酶A的变化
最后，为了进一步提高多杀菌素的产量，作者针对其发酵培养基中的成分进行了一系列优化。通过发酵过程中残糖和产量的测定，发现多杀菌素的产生依赖于培养基中的残糖的含量。作者将发酵培养基中葡萄糖的浓度从4％提升至4.8％，结果显示，经过8天的发酵，ADE-AP中多杀菌素的产量提升了25.59％，达到了68.39mg/L，而ADE的产量反而有所下降。作者认为这两种菌株之间的性能差异可能是由于葡萄糖使用效率的不同。在ADE中，额外的葡萄糖似乎阻止碳原子流向多杀菌素合成。然而，ACC、PCC和AcsA在ADE-AP中过表达似乎会引起一系列碳源流向多杀菌素的合成中，导致产量上升。作者还针对培养基中速效碳源葡萄糖用蔗糖，果糖，甘露醇，麦芽糖等进行替换，结果发现麦芽糖能够进一步提升发酵产量，达到了70mg/L。但是由于目前产物均为胞内产物以及摇瓶发酵的限制导致产量无法进一步增加。
本篇工作通过重构白色链霉菌J1074中多杀菌素的PKS合成基因，以及优化前体的供给等方式，构建了已知文献报导过的以链霉菌为底盘的多杀菌素异源合成的最高产量菌株，同时通过培养基优化的方式，进一步提升了发酵产量，可与一些天然的多杀菌素生产菌株持平。该项工作为高产多杀菌素提供了有效的思路和方法，也为异源表达其余的天然产物提供了一种策略。并且，目前该项工作报道的70 mg/L的产量仅仅只是出于摇瓶发酵水平，可以进一步通过发酵罐放大的方式更深层次的验证该菌株的多杀菌素产生能力，因此，该菌株具有相当的发展潜力。
参考文献：
【1】Heterologous Biosynthesis of Spinosad: An Omics-Guided Large Polyketide Synthase Gene Cluster Reconstitution in Streptomyce; DOI: 10.1021/acssynbio.6b00330.
文章信息
Increasing the heterologous production of spinosad in Streptomyces albus J1074 by regulating biosynthesis of its polyketide skeleton
Ziheng An#, Hui Tao#, Yong Wang, Bingqing Xia, Yang Zou, Shuai Fu, Fang Fang, Xiao Sun, Renqiong Huang, Yao Xia, Zixin Deng, Ran Liu*, Tiangang Liu*
Synthetic and Systems Biotechnology, Volume 6, Issue 4, December 2021, Pages 292-301
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期刊简介
Synthetic and Systems Biotechnology 是高质量国际开放获取期刊，创刊于2016年。该期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域的各个方面。
本刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus等数据库收录。
2021年获得第一个影响因子：4.708，Q1区
2020CiteScore: 8.4，学科领域排名14/113。
本刊入选2019年中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊项目。
本刊是中国生物工程学会合成生物学专业委员会的会刊。
本刊是生物反应器工程国家重点实验室的官方期刊。
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