中科院微生物所吴边与娄春波团队合作改造出人工进化和优化设计更广谱的dCpf1碱基编辑工具 | SSB
基因编辑技术是研究细菌遗传机理、药物生产以及代谢工程等方面的重要手段。其中，近年来被广泛应用的CRISPR/Cas编辑系统相比于传统的细菌基因编辑方法无疑是一种更为高效便捷且无痕的基因编辑工具。然而，由于大多数细菌缺乏非同源末端修复途径，由Cas核酸酶产生的DNA双链断裂极有可能导致细胞生长异常。
碱基编辑器是近两年发展起来的新型基因组编辑工具，它将碱基脱氨酶的催化活性和CRISPR/Cas系统的靶向特异性进行结合，催化DNA或RNA链上特定位点的碱基发生脱氨基反应，进而完成碱基的替换。这种新型编辑技术的发展为细菌学相关研究开辟了新的途径，其相比于CRISPR/Cas编辑系统是一种更为精准高效的基因编辑技术且不会造成细菌死亡。因此，如何实现细菌基因组中任意靶点的编辑且保持较低脱靶率是碱基编辑技术在细菌种群中应用所需要主要考虑的问题。
面对这个问题，中科院微生物所吴边与娄春波团队合作，在原核生物单碱基编辑技术研究方面取得新进展，在Synthetic and Systems Biotechnology发表了文章“Engineered DNase-inactive Cpf1 Variants to Improve Targeting Scope for Base Editing in E. coli”，报道了如何通过定向进化扩展FnCpf1核酸酶的PAM识别序列，并在大肠杆菌基因组上实现了多靶点的碱基编辑。
该工作选择脱靶率低、识别PAM序列主要是T富含序列、有RNA内切酶活性的dFnCpf1作为进化对象，针对8个GC富含的PAM序列（SSSC,S=C/G）分路径定向进化。他们首先在体外构建了突变库，并利用在大肠杆菌中构建的基于荧光的高通量筛选系统对dFnCpf1突变体进行流式分选，不断富集能提高对应PAM识别能力的突变位点并在下一轮进行叠加。通过四轮定向进化，该团队分别从8条PAM进化路径中获得目的突变蛋白。对这些蛋白进行PAM偏好谱的分析后发现这些突变蛋白并非识别特定的PAM序列，而是具有了相比于野生型更广的的PAM识别范围。其中PAM识别范围最广（相比于野生型扩大了10倍）的突变体VRGN/Y724C/F570L/R690I/L662I被命名为dbsFnCpf1。
在获得了广谱型的bsdFnCpf1突变体后，他们将其与胞嘧啶脱氨酶APOBEC1与尿嘧啶DNA糖苷酶抑制因子相融合构建胞嘧啶碱基编辑器，在质粒上实现了广谱高效的碱基替换以及在大肠杆菌基因组上实现了6个具有不同PAM序列位点的同时编辑，编辑范围远远超过之前报道的enAsCpf1且编辑效率最高可达85%。bsdFnCpf1对GC富含的PAM序列的有效识别极大地扩展了其在基因组上的编辑范围。由于bsdFnCpf1不依赖于任何额外的或宿主依赖的因素，该技术同样适用于其他细菌，为CRISPR-dCpf1系统在多基因调控以及碱基编辑等合成生物学方面的应用提供了更高的灵活性和广泛的适用性，为加速原核生物基因功能研究建立了良好的技术平台。
通过结构模型比对可以看到bsdFnCpf1的突变位点分散在PAM序列的近端和远端。距离PAM序列较近的K671R和K613N通过改变氨基酸与碱基的相互作用直接影响了对PAM的兼容性。距离PAM序列较远的其他突变点可能产生了微小的结构变化从而间接影响了蛋白对PAM的识别。因此，通过定向进化可以获得结构解析无法触及的远端突变，这些突变很有可能对蛋白的性能有间接作用，将定向进化与基于结构的半理性设计相结合将是CRISPR核酸酶改造的重要手段。
中国科学院微生物研究所的博士研究生陈泽华为该研究的第一作者，娄春波研究员与吴边研究员为共同通讯作者。该项研究得到了中国科学院种子精准设计与创造先导专项的支持。
文章信息
Engineered DNase-inactive Cpf1 variants to improve targeting scope for base editing in E. coli
Zehua Chen, Jinyuan Sun, Ying Guan, Ming Li, Chunbo Lou, Bian Wu
Synthetic and Systems Biotechnology
Volume 6, Issue 4, December 2021, Pages 326-334
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期刊简介
Synthetic and Systems Biotechnology 是高质量国际开放获取期刊，创刊于2016年。该期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域的各个方面。
本刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus等数据库收录。
2021年获得第一个影响因子：4.708，Q1区
2020CiteScore: 8.4，学科领域排名14/113。
本刊入选2019年中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊项目。
本刊是中国生物工程学会合成生物学专业委员会的会刊。
本刊是生物反应器工程国家重点实验室的官方期刊。
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