小分子药物的新时代？—“独步江湖”的化学蛋白组学（下）
撰文 | Anosniff
2017年4月7日
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祝厦门大学96岁生日快乐，永葆活力！
引言
上篇《小分子药物的新时代？—“独步江湖”的化学蛋白组学（上）》介绍了小分子药物研发“万靶俱备，只欠好箭”的新思路，并且重点介绍了化学蛋白组学小哥的第一个绝技——龙爪手，下篇将介绍另外三大绝技，分别为吸星大法，金钟罩和引天雷。不妨先对这位小哥练的四大绝技的境界打打分（最高九层），结果大致如下：
龙爪手：第七层 吸星大法：第八层
金钟罩：第四层 引天雷：第五层
正文
II 吸星大法——激酶珠球筛选法
“吸星大法是金庸小说《笑傲江湖》中的日月神教教主的武功。这套内功是将别人的内力吸收，将这些别人的内力化成自己体内的内力，或将真气排出，但是被吸的人功力越深厚越难成功。”
蛋白激酶是最具吸引力的药物靶点。ATP结合口袋的竞争性抑制剂是最早一类广谱的激酶抑制剂，因为这种抑制剂往往可以跟一大堆激酶结合。显然，它们毒性是很大的，无法成为药物，但却可能变废为宝。
激酶珠球是一种偶联了多个非特异性的激酶抑制剂的琼脂糖珠。这些激酶珠球因为集合了多个抑制剂于一身，内力暴增，它能“吸住”细胞或组织裂解液中大多数的蛋白激酶，可以被用于定量测定其他抑制剂的选择性。如果其他抑制剂对某个靶点结合能力更强（“功力”比激酶珠球更深厚），它就可以把这个靶点激酶从球珠上“解救”下来，从而直接测量出激酶和这个抑制剂的相对亲和力。（图一）
与人工构建的体外激酶库法和ATP共价探针法相比，激酶珠球法是最简便的方法(Bantscheff et al., Nature biotechnology, 2007)。琼脂糖珠上偶联的多种不同类别的激酶抑制剂，可以捕获多达几百个激酶。借助质谱和同量异位化学标签（iTRAQ，一种同位素衍生化方法）(Ross et al., Molecular & cellular proteomics: MCP, 2004)，人们可以同时检测到一个抑制剂对多个激酶的IC50。
图一：激酶珠球工作原理和流程
例子：“为了展示激酶珠球的实用性，Bantschef和同事研究了几种药物如imatinib，dasatinib和bosutinib的抑制活性(Bantscheff et al., Nature biotechnology, 2007)。首先将表达BCR-ABL融合蛋白的K562细胞裂解液与递增浓度的每种激酶抑制剂（100pM-10μM）保温，然后加入激酶珠球。珠子捕获的激酶通过蛋白酶降解成肽段和iTRAQ试剂标记，质谱法分析后可以得到所有三种药物的IC50值。这一技术的额外用途是它可以识别非激酶药物靶点。这一方法还证实imatinib对氧化还原酶NQO2的有效抑制。使用这一方法的一个注意事项是，内源性的核甘类辅因子如ATP，会严重影响IC50值的测定，为了避免干扰，可以通过凝胶过滤一下裂解液以除去辅因子。”
虽然激酶珠球是为了寻找特异性的激酶抑制剂而设计的，但它同样适用于测量两个细胞系之间的激酶表达的差异。为了扩大激酶珠球方法的范围，新一代的激酶珠球能够捕获更广泛的激酶家族。
“最新的一个例子(Golkowski et al.,Journal of proteome research, 2017）展示了新一代激酶珠球可以做到从11种癌症细胞中捕获312激酶的强大内力。最后，激酶珠球方法与ATP共价探针法比较表明，这两种方法是互补的，一起使用，可以达到激酶的最大覆盖率。”
III 金钟罩—蛋白稳定性寻靶法
“金钟罩铁布衫是中国功夫中最有名的护体硬气功了，传说练成金钟罩铁布衫的人不但可以承受拳打脚踢而丝毫无损，甚至普通的刀剑也伤不了他们。”
蛋白其实很容易受伤，比如说热变性，被水解和被氧化。 如果有化学分子结合到蛋白上，那么大多数情况下，蛋白的稳定性会增加，相当于有了金钟罩铁布衫护身。利用LC-MS来监测化学分子诱导的蛋白质热力学稳定性的蛋白组学统称为“稳定性蛋白质组学”。这个方法可以在有或没有化学分子的情况下，普查被化学分子稳定化或去稳定化的蛋白质。这类方法的优点是不需要化学衍生化，或者把化学分子和靶蛋白固定在基质上。此外，它们还可以检测目标靶蛋白或者脱靶蛋白和药物分子的直接或者间接作用，因此，它的最大潜力是可以识别以前未知的脱靶蛋白。
值得一提的是，2013和2014年两篇Science报道的CETSA（Cellular Thermal Shift Assay）这一新方法(Martinez Molina et al., Science, 2013; Savitski et al., Science, 2014)，利用CETSA不但可以考察配体分子对目标靶蛋白的结合力（通过抗体显色, 可以用于筛选分子库），而且可以鉴定出原来未知的靶蛋白（通过LC-MS，可以找脱靶蛋白）。CETSA的原理（图二上）并不复杂，使用10个等份的对照样品（DMSO处理的）和10个等份的用配体处理的样品。样品制备可以使用完整细胞或者裂解物。将一组中的每个等份样品暴露于一系列温度之一，然后通过离心除去变性/聚集的蛋白质，没有变性的可溶蛋白通过胰蛋白酶降解和标记后，再利用质谱定量分析可以得到两条“熔化曲线”，计算出来的熔点差ΔTm值，用来指示配体和靶点有无作用。如果固定加热温度和加热时间，通过改变配体的浓度就可以得到配体浓度响应曲线（注意：不是真正到结合常数）。CETSA的一大优势是可以应用于活细胞体系。
图二：CETSA和SPROX的原理
另一个基于类似原理的新方法被称之为SPROX (“stability of proteins from rates of oxidation”) (Strickl and et al., Nature protocols, 2013) 。它的原理是基于配体结合可以增强蛋白抗氧化能力（图二下）。与CETSA一样，SPROX将用DMSO（作为对照）或配体处理的蛋白质混合物等分，加入不同浓度的变性剂和过氧化氢，使暴露的甲硫氨酸侧链被氧化标记。甲硫氨酸的氧化程度用于报告在每种变性剂浓度下的折叠平衡，利用质谱定量，得到两条有无配体存在下的SPROX曲线，半变性时的变性剂浓度差ΔC1/2值，就能指示配体和靶点有无作用。
配体结合不但对蛋白的热稳定性有影响，而且对蛋白的抗蛋白酶水解稳定性也有影响，由此诞生了另两个工具，分别是DARTS （drug affinity-responsive target stability，可译为“亲药靶点稳定效应法”）(Lomenick et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009)和 LiP-SRM (limited proteolysis coupled with single reaction monitoring，可译为“单反应监测偶联的限制蛋白水解法”) (Liu et al., Journal of molecular biology, 2011)。前者DARTS，基于配体结合使蛋白质可以抵抗蛋白酶降解，接着用蛋白组学质谱分析多肽片段强度变化可以用来提供目标靶点对配体的结合响应，具有无需标记的优点，但实验需要预先优化条件。后者LiP-SRM与DARTS（图三）类似，是在蛋白只部分降解时，利用LC-MS和SRM（单反应监测质谱技术）提高定量精度。同样，LiP-SRM需要额外的优化步骤，并且由SRM来定量需要预先知道靶点信息，所以Lip-SRM只能算是一种高灵敏度验证配体和靶点作用的方法。
图三：DARTS和LiP-SRM的原理
与所有其它蛋白质组学方法一样，基于蛋白稳定性的蛋白质组学技术所发现的配体／靶点，需要其它方法（如，western-blot）进行验证。稳定性蛋白质组学的各种新兴方法向研究人员提供了发现药物分子新靶点的潜力，因为知道了候选药物的所有靶点，药物化学家就可以提前对它们在体内和临床上的潜在毒性进行规避。迄今为止利用这些方法报道的几个新型靶点鉴定，只是来自技术发明者自己的实验室，因此，这些技术的通用性仍有待观察。不过，与SPROX类似原理的SUPREX技术（基于蛋白质稳定性的H/D交换速率法(Tang et al., mAbs, 2013)）已经在科学界中广泛使用，随着时间推移，这些新的稳定性蛋白质组学技术或许可以进入其他实验室。
IV 引天雷——诱导灭靶法
什么叫“引天雷”？上一节技术细节有点枯燥，先来一则笑话，轻松一下：
猴子捡到一张卡，他想看清楚是什么卡，就爬到树枝上看，这时一个雷击中了他，猴子哭着说：原来是IP（挨劈）卡啊！ 大猴子和小猴子手牵手在路上走，捡到一张卡，这时一个雷击中了他们，两猴子哭着说：原来是“联通IP卡”啊！ 猴子骑自行车，捡到一张卡，继续上路，这时一个雷击中了他，猴子哭着说：原来是“移动IP卡”啊！”
笑过之后，我们来看看化学蛋白组学里是怎么给靶点蛋白“引天雷”的，以及这一思路在活性小分子调控靶点水平中的具体应用。 众所周知，一个蛋白如果被贴上泛素蛋白这一标签，那么它就等着被“雷劈”了，因为细胞将启动蛋白水解酶复合体来降解它。如果可以借助这一机制来实现对疾病靶点蛋白水平的调控，是不是会很酷？ PROTACs（proteolysis targeting chimeras）(Deshaies, Nature chemical biology, 2015)就是用于这一目的的一类双功能小分子，它能同时结合靶蛋白和泛素化酶，可谓“一手索命钩，一手引雷符”，先钩住靶蛋白，接着给它贴上“IP卡”，贴泛素标签的过程是通过泛素化酶E3（人体E3家族有500～1000个成员）和E2（35个成员）这两“魔王”合力完成的（图四）。近期文献中出现了一些高效，特异性强的PROTAC报道，让我们得以窥探PROTAC这一潜在新疗法的前景。
图四：PROTAC原理(Deshaies, Nature chemical biology, 2015)
人们最初采用的PROTAC“引雷符”配体是泛素化酶的多肽底物类似物，由于这些多肽的尺寸大，细胞穿透和代谢差，应用受到了极大的限制。经过多年的发展，泛素化酶的配体性能已经有了质的飞跃，涌现出了两类优秀的，低分子量，高亲和力配体（E3的配体），被成功地用于装配有效的PROTACs。第一类高性能E3配体为含羟基脯氨酸的三肽，可以结合E3的CRL2VHL结构域（亲和力320nM）。另一个高活性的PROTAC使用沙利度胺（Thalidomide）作为配体（相关分子统称为亚酰胺类免疫调节药物，简称IMiD）。PROTAC疗法是一个全新的概念，它有别于传统的“靶点占据式”的抑制剂疗法，它通过催化降解靶蛋白的方式来调低靶蛋白活性，由于靶蛋白的生物重新合成较慢，这一方式可以大大减缓靶蛋白活性的恢复。PROTAC已经被成功应用于多个目标靶点和多种细胞类型，有望成为一个平台技术。
当然，PROTAC也有缺点，双功能分子个头不小，口服生物利用率差，以及潜在的药代动力学（PK）如吸收，分布，代谢，排泄和毒性（ADMET）问题。Bondeson等人的药效研究发现，细胞中目标蛋白只是减少了不到50%，比按照血清中药物浓度估算的值少了一大截。此外，Winter等人报道了另一例PROTAC，虽然抗肿瘤活性不错，但是它的半衰期仅为40分钟。(文献见 Deshaies, Nature chemical biology, 2015的引用) 如果能够有效地解决上述问题，PROTAC潜力是无限的。它原则上可以产生特定小分子配体作用于任何蛋白质，而无需考虑靶蛋白是否是通常认为的“可成药的”（一般认为只有受体或酶是“可成药的”）。如此来看，PROTAC具有针对不同靶点和治疗领域的通用性，有望与蛋白激酶抑制剂或单克隆抗体相媲美，自成一派。PROTACs的淘金热似乎才刚刚开始……
V 展望
随着合成化学和分析仪器的不断发展，化学蛋白组学在药物发现中应用一定会有更多的技术突破。笔者认为，四大绝技的组合使用至少会是一个方向。比如，龙爪手＋引天雷组合，龙爪手共价键擒靶法有个缺点，那就是有些分子可以结合靶点蛋白，但却不能调控靶点的活性。如果把引天雷的PROTAC技术结合进来，那么只要小分子可以接近靶点，就有可能被泛素化，进而被降解调控。引天雷的另外一个可能的应用，把任意药物骨架分子改造成PROTAC，让它进入细胞去到处引雷闯祸，接着找出哪些蛋白被干掉了，那么这个药物骨架就是那些靶点很好的hit了。因此，化学蛋白组学小弟后生可畏。不久前，Novartis挖走PROTAC技术的重塑者James E. Bradner担任Novartis Institutes for BioMedical Research的总裁。此外，Scripps的Benjamin Cravatt成立全球第一家基于化学蛋白组学的初创公司Vividion （天使轮融资不到一年，又于今年2月完成了5000万美元的A轮融资），开始了新药的大规模“捕捞”。由此可见，小分子新药发现的新时代其实已经悄然开启！
作者简介
倪锋 厦门大学化学系学士，有机化学博士。南加州大学化学系博士后，高级研究员，高级科学家研究员。先后十余年一直从事功能探针和药物探针分子设计，并应用于生物固氮酶，蛋白激酶和GPCR蛋白的研究。现担任洛杉矶TarGead Sciences CEO，利用高通量先导药物和靶蛋白发现技术平台，进行先导药物/靶点发现并转让授权，同时向医药研发同行提供先导药物/靶点验证服务与靶点发现合作。
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（感谢Amgen的高级研究员闫杰和BioVinc LLC的COO&CTO孙淑婷博士在本系列文章撰写过程中给的建议。）
参考文献：
Bantscheff,M., Eberhard, D., Abraham, Y., Bastuck, S., Boesche, M., Hobson, S., Mathieson,T., Perrin, J., Raida, M., Rau, C., et al. (2007). Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.Nature biotechnology 25, 1035-1044.
Deshaies, R.J. (2015). Protein degradation: Prime time for PROTACs. Nature chemical biology 11,634-635.
Golkowski, M., Vidadala, R.S., Lombard, C.K., Suh,H.W., Maly, D.J., and Ong, S.E. (2017). Kinobead and Single-Shot LC-MS Profiling Identifies Selective PKD Inhibitors. Journal of proteome research 16, 1216-1227.
Liu, P.F., Kihara, D., and Park, C. (2011). Energetics-based discovery of protein-ligand interactions on a proteomic scale .Journal of molecular biology 408,147-162.
Lomenick, B., Hao, R., Jonai, N., Chin, R.M., Aghajan,M., Warburton, S., Wang, J., Wu, R.P., Gomez, F., Loo, J.A., et al. (2009). Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 21984-21989.
Martinez Molina, D., Jafari, R., Ignatushchenko, M.,Seki, T., Larsson, E.A., Dan, C., Sreekumar, L., Cao, Y., and Nordlund, P.(2013). Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science 341,84-87.
Ross, P.L., Huang, Y.N., Marchese, J.N., Williamson,B., Parker, K., Hattan, S., Khainovski, N., Pillai, S., Dey, S., Daniels, S.,et al. (2004). Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiaeusing amine-reactive isobaric tagging reagents. Molecular & cellular proteomics : MCP 3, 1154-1169.
Savitski, M.M., Reinhard, F.B., Franken, H., Werner,T., Savitski, M.F., Eberhard, D., Martinez Molina, D., Jafari, R., Dovega,R.B., Klaeger, S., et al. (2014). Tracking cancer drugs in living cells by thermal profiling of the proteome. Science346, 1255784.
Strickland, E.C., Geer, M.A., Tran, D.T., Adhikari,J., West, G.M., DeArmond, P.D., Xu, Y., and Fitzgerald, M.C. (2013). Thermodynamic analysis of protein-ligand binding interactions in complex biological mixtures using the stability of proteins from rates of oxidation. Nature protocols 8, 148-161.
Tang, L., Sundaram, S., Zhang, J., Carlson, P.,Matathia, A., Parekh, B., Zhou, Q., and Hsieh, M.C. (2013). Conformational characterization of the charge variants of a human IgG1 monoclonal antibody using H/D exchange mass spectrometry. mAbs5, 114-125.
本文独家首发于微信公号《药时代》（原《医药研发社交平台》）。
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作者： Anosniff
出处： 药时代（ID：drugsns）
编辑：Walker 配图：网络
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