Nature | 第一个降解病毒蛋白的PROTAC分子

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2019年8月1日，哈佛医学院的Priscilla L. Yang教授课题组在《Nature Communications》上发表了降解丙肝病毒蛋白酶的PROTACs分子研究文章。

亮点1：设计了第一个有效降解病毒蛋白的PROTACs分子。

亮点2：该PROTACs分子具有抑制和蛋白降解的双功能。

亮点3：证明了降解病毒蛋白的新策略可解决病毒抑制剂的耐药问题。

一

摘要

靶向蛋白降解是一种很有前景的新药开发技术。这里，我们利用这一技术开发出一类新的PROTAC抗病毒分子，其可诱导病毒蛋白酶体降解。Telaprevir是一种与丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶活性位点结合的可逆共价抑制剂，与CRL4^CRBN的配体组合的PROTAC分子既能抑制又能诱导HCV的NS3/4A蛋白酶降解。优化后的PROTAC分子DGY - 08 -097在细胞感染模型中能有效抑制HCV，证明了蛋白质降解有助于其抗病毒活性。最后，研究者还证明这种新型抗病毒PROTAC分子可以克服病毒变异，解决了对传统蛋白抑制剂如telaprevir的耐药性问题。总之，该研究工作验证了靶向降解目标蛋白可能为开发针对耐药病毒的新药提供新的解决方案。

二

背景

在抗病毒研究中，主要需要对具有高耐药性的病毒实现有效的广谱抑制。传统的抗病毒药物发现策略之一是开发高亲和力配体，其结合并抑制病毒蛋白的功能，例如病毒聚合酶和蛋白酶。虽然这种策略已被证明对人类免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）等病毒非常有效，但强效和特异性抗病毒药物的开发需要进行大量投资，但这种开发路线不能轻易被复制，以对抗其它现有和新出现的病毒。抗病毒药物开发的另一个主要挑战是耐药性的出现，在用靶向病毒酶抑制剂的单一疗法期间，这种耐药性快速发生。故，急需采用新的抗病毒策略，通过利用全新的作用机制来对抗病毒性疾病，以克服上述挑战。

靶向蛋白降解最近已成为一种替代抑制剂的新药理学机制，与传统的占据驱动的药理学相比，其具有几个潜在的优势。蛋白的靶向降解可以通过开发通常称为靶向蛋白降解嵌合体（PROTAC）分子来实现。这些合理设计的小分子由与E3泛素连接酶募集配体和目标靶蛋白特异性配体通过Linker连接组成。PROTAC分子促进两种蛋白的相互作用，从而诱导目标靶标的泛素化和随后的蛋白酶体降解。该原理已成功地应用到多个目标，包括激酶（RIPK2、BTK、BCR-ABL、CDK9）和转录酶（BRD4、BRD9、TRIM24）以及很多其它蛋白，该技术已被各大制药企业广泛部署为重要的新药发现战略，如诺华、艾伯维和吉利德等。

由于在癌症和抗病毒药物发现中都具有靶标特异性和耐药性的类似挑战，我们认为靶向蛋白降解可能有利于开发新的抗病毒药物。由于PROTAC分子需要对靶标蛋白的亲和力比传统的基于占据的抑制剂低得多，因此它们可能不易受点突变的影响，这些点突变可显着影响现有抑制剂的功效。这表明，PROTAC分子可能会表现出相对于常规抑制剂的不同性质。降解EGFR蛋白的另一个潜在优势是废除了靶蛋白的所有功能（酶促、结构和支架等全部功能），这将导致更高的药物效力，故在针对多功能病毒靶标方面可能有特别的效果。此外，靶向蛋白降解可能降解许多“不可成药”的病毒蛋白，或功能未知的病毒蛋白。

据估计，全世界有7100万持续感染HCV的患者。HCV是肝病的主要致病因素，会导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌。HCV的单链RNA可编码多种病毒蛋白。细胞和病毒蛋白酶会对病毒蛋白水解切割，产生10种病毒结构蛋白和非结构蛋白。HCV的NS3蛋白在感染周期种执行多种功能。NS3的C末端部分具有解旋酶活性，其对于病毒RNA基因组的复制至关重要。NS3的N-末端部分连同其辅因子NS4A构成丝氨酸型蛋白酶。这种病毒蛋白酶切割HCV多聚蛋白，以及细胞蛋白，如MAVS和TRIF（这是参与细胞免疫应答的两种蛋白）。虽然NS3的蛋白酶和解旋酶活性对于病毒感染都很重要，但只有NS3/4A蛋白酶已被成功地用作药物靶标。

Telaprevir（VX-950）是第一代拟肽蛋白酶抑制剂，2011年被批准用于HCV治疗。Telaprevir的α-酮酰胺与催化丝氨酸发生可逆共价反应，形成半缩酮。这一类蛋白酶抑制剂的亲和力较低，且容易快速出现突变导致耐药性。由于Telaprevir的快速耐药和高效的抗病毒药物出现，导致其退出市场。现有高效的直接作用抗病毒药物，仅在治疗8周后即可完全治愈。

为了验证靶向蛋白降解可作为抗病毒药物开发的策略，研究者选择HCV的NS3/4A蛋白酶作为目标蛋白。使用Telaprevir作为蛋白酶结合配体，设计了可以靶向降解HCV的NS3/4A蛋白酶的PROTAC分子。Telaprevir与病毒蛋白酶的高分辨率复合物结构（PDB ID: 3SV6）提示研究者选择合适的Linker连接位点来设计PROTAC。研究者设计了三种PROTACs，这些化合物保留了一些抑制病毒蛋白酶活性功能，同时拥有诱导NS3靶向降解的能力。最有趣的是，这些PROTACs对Telaprevir耐药突变的病毒仍然表现出抗病毒活性，这表明靶向蛋白降解技术对于开发新的抗病毒药物是一种有极具潜力的策略。

三

结果

1、设计靶向HCV蛋白酶的PROTAC

研究者基于病毒蛋白酶与Telaprevir的共晶结构，合成了由Telaprevir （HCV的NS3 / 4A蛋白酶的配体）构成的PROTACs分子（图1a，b）。溶剂暴露的吡嗪环连接不同的CRBN（E3）配体。研究者测试了PROTACs分子与NS3和CRBN的结合，在体外可抑制NS3/4A催化活性，并开展了基于细胞的CRBN抑制活性试验（图1），三种化合物的结果见图1a。DGY - 03 - 081和DGY - 04 - 035与CRBN结合部分分别是那度胺和泊马度胺，它们是两种免疫调节性酰亚胺药物（IMiD），经常被用作CRBN结合剂。DGY - 08 - 097则采用了新的三环酰亚胺部分，该部分对CRBN具有优异的亲和力，并且不诱导IMiD新底物如IKZF1和IKZF3的降解。三种PROTACs分子均具有纳摩尔级的IC₅₀值，以抑制HCV的NS3/4A蛋白酶活性（图1c）。它们也与细胞内的CRL4^CRBN结合，如先前报道的与来那度胺竞争性结合试验（图1d）所示，且在细胞热转移试验中证明DGY - 08 - 097对细胞中CRBN有浓度依赖性。

图1、降解病毒蛋白的PROTACs分子和蛋白抑制活性

2、PROTACs分子选择性降解HCV的NS3蛋白

为了研究PROTACs分子诱导HCV的NS3蛋白降解，研究者构建了诱导型细胞系，其表达与eGFP融合的全长HCV的NS3蛋白，并通过FMVD的2A核糖体跳跃序列与mCherry连接（图2）。在该系统中，测量eGFP / mCherry荧光的比率则可监测NS3 - GFP融合蛋白的丰度。研究者证明了三种PROTACs分子以浓度依赖性方式降低细胞内NS3蛋白（图2a）。与以前的报道相一致，研究者观察到，当降解活性达到最大，再增加化合物浓度将导致NS3蛋白降解活性的迅速降低（图2a）。这种“钩状效应”是因为PROTACs分子与NS3和CRBN结合产生的二元复合物将干扰有效泛素标记所必需的三元复合物形成。DGY - 08 - 097表现出对HCV的NS3最有效的降解（4小时DC₅₀为50nM）（图2a）。

图2、PROTAC对细胞内eGFP标记的病毒蛋白降解活性

为了确认PROTACs分子对目标蛋白降解的选择性，我们用DGY - 08 - 097和DGY - 08 - 097 - BUMP处理细胞4小时后进行了基于定量质谱的蛋白质组学研究，戊二酰亚胺的甲基化后不能结合CRBN的类似物（图1a）。这种方法证实了HCV的NS3病毒蛋白在细胞中被PROTAC分子很快降解（图2b）。这种对NS3的作用是特异性的，因为没有观察到定量的~8700的其它蛋白质被DGY - 08 - 97显着影响，NS3的丰度也不受阴性对照化合物DGY - 08 - 097 - BUMP的影响。此外，在DGY - 08 - 097存在下，研究者未检测到IMiDs新底物如IKZF1和IKZF3的降解。

3、PROTACs分子降解HCV的NS3需要招募CRBN

为了验证PROTACs分子降解HCV的NS3的机制，研究者使用化学扰动的方法来观察其与CRBN的结合。DGY - 04 - 035 - BUMP和DGY - 08 - 097 - BUMP在体外均能抑制NS3 / 4A功能，这表明此2种化合物均可与NS3蛋白结合。然而，在瞬时测定中，两种化合物都没有诱导NS3降解（图2c），这是因为它们不与CRBN结合。此外，研究者还发现过量的CRBN配体，如来那度胺在DGY - 03 - 081，DGY - 04 - 035和DGY - 08 - 097存在下可使得HCV的NS3蛋白免于降解（图2d）。总之，这些数据支持DGY - 03 - 081，DGY - 04 - 035和DGY - 08 - 097诱导的NS3降解是CRBN依赖性，也就是说NS3的降解的确是通过泛素标记体系E3（CRBN）实现的。

4、HCV的NS3降解有助于抗病毒活性

在验证了基于Telaprevir的PROTACs分子的靶向蛋白降解机制后，研究者接下来评估了这些化合物在HCV感染性试验中的抗病毒活性。所有三种PROTACs分子均表现出了抗病毒活性，且没有任何细胞毒性，直至浓度为10 - 40μM（图3a）。抗病毒活性（图3a）与NS3的强效降解相关（图2a），DGY- 08 - 097表现出最强的抗病毒活性（IC₅₀ = 748 nM）和最有效的NS3降解。而另外两种PROTACs分子在两种抗病毒试验中表现出较低的有效活性（DGY - 03 - 081, IC₅₀ = 3069 nM；DGY - 04 - 035, IC₅₀ = 2920 nM）和NS3降解活性（图2a）。

图3、PROTACs分子的蛋白降解和抗病毒活性

传染性病毒的产生，以及病毒蛋白的细胞积累和感染周期的其它几个过程，都完全依赖于病毒酶的功能。因此，用Telaprevir治疗导致细胞内病毒载量和细胞内NS3蛋白的减少，这仅仅是由于HCV的NS3/4A蛋白酶活性的抑制（图3b, c）。因为三种PROTACs分子都具有病毒蛋白NS3的活性抑制功能（图1c），研究者试图区分抑制和降解靶向蛋白的药理学效果。为确保PROTAC是通过CRBN依赖性降解靶蛋白，从而实现抗病毒作用的，他们利用化学和遗传扰动的方法评估了PROTACs分子对CRL4^CRBN活性的依赖（图3b, c）。通过加入Neddylation抑制剂MLN4924，维持了细胞内NS3蛋白的丰度，证实了PROTACs分子的抗病毒效果与CRL4^CRBN活性相关（图3b）。为了进一步证明对CRBN的依赖，研究者使用CRISPR编辑技术设计了CRBN敲除的Huh7.5细胞系。当比较PROTACs分子对野生型和CRBN敲除的细胞中NS3蛋白丰度的影响时，研究者发现，在缺乏CRBN的细胞中显着避免了HCV的NS3蛋白降解，且Telaprevir对其抗病毒活性并不依赖于CRBN（图3c）。有趣的是，即使在等于或大于“钩状效应”的浓度下，研究者也观察到了DGY-08-097对抗病毒活性的浓度依赖性（图2a）。这可能是由于测定的感染性病毒模型中NS3丰度的差异导致，但也可能是由于抑制而不是在较高浓度下对HCV的NS3/4A蛋白酶的降解。这些数据支持PROTACs依赖于CRBN的抗病毒活性，并表明这种策略能够同时通过两种不同机制发挥其抗病毒活性：抑制和降解病毒蛋白酶。

5、PROTACs对Telaprevir耐药的NS3变体依然具有活性

开发靶向病毒蛋白抑制剂的主要障碍是病毒快速耐药。目前，已经鉴定了许多HCV变体，如对Telaprevir和其他酮酰胺化合物耐药的病毒。其残基A156处的突变延长了α-酮酰胺头部和催化丝氨酸之间的键，因此潜在地降低了共价结合的能力，从而降低了抑制剂效力。该类抑制剂的疏水性侧链匹配多个底物结合口袋，并且两个高分辨率结构和分子动力学模拟表明：这些相互作用的互补性可能受到残基V36、T54和V55抗性突变的影响。为了确定靶向蛋白降解是否可以对耐Telaprevir抗性病毒具有抗病毒活性，研究者开展了基于Telaprevir设计的PROTACs分子对携带V55A或A156S突变的HCV克隆（分别为HCV - NS3 - V55A和HCV - NS3 -A156S）的活性试验。有趣的是，虽然两种突变体都表现出对Telaprevir治疗的抗性，但研究者观察到，PROTACs分子DGY - 08 - 097保留了对两种突变病毒的抗病毒作用，并降低了NS3丰度和感染性病毒的产生（图4）。同时，也注意到虽然NS3 - A156S突变降低了对DGY - 08 - 097的敏感性，但抗病毒效力的变化仅为3倍（野生型，IC₅₀ = 558 nM；NS3 - A156S，IC₅₀ = 1561 nM），而Telaprevir则为10倍（野生型，IC₅₀ = 98 nM; NS3 - A156S，IC₅₀ = 949 nM）。NS3 - V55A突变体是已知作为天然多态性存在的病毒。与先前的报道一致，研究者发现该突变体对Telaprevir具有一定的抗性，抗病毒效力仅有3倍的变化（野生型, IC₅₀ = 98 nM; NS3 - V55A, IC₅₀ = 288 nM）。值得注意的是，DGY - 08 - 097具有与野生型病毒和NS3 - V55A突变体类似的抗病毒活性（野生型, IC₅₀= 558 nM; NS3 - V55A，IC₅₀ = 508 nM）。总而言之，这些结果证明：小分子蛋白降解剂PROTACs分子在解决耐药性病毒的问题方面具有绝对的优越性。

图4、PROTACs分子对耐药性病毒的活性

四

讨论

靶向蛋白降解已成为一种强有力的新药开发策略。该方法可以用于开发泛素化目标蛋白并诱导其降解的PROTAC小分子药物。如沙利度胺 + Linker +抑制剂来设计的PROTAC分子，该分子是将已知的目标蛋白配体与E3配体通过Linker连接起来。在该试验中，研究者利用PROTACs分子诱导病毒HCV的NS3/4A蛋白酶降解产生抗病毒活性。主要精力是集中在开发解决病毒编码（而非宿主编码）的蛋白质上，因为今天绝大多数成功的抗病毒药物都是直接作用于病毒的药物，包括那些现在治愈HCV并使其长效的药物。其中，直接作用病毒的药物最常见的靶标是病毒聚合酶和蛋白酶，因为它们具有确定的酶活性，并且数十年的药物发现经验为这些靶蛋白找到了各种类别的配体分子。靶向蛋白降解具有许多潜在的优点，这使得该方法与传统抑制剂互补。首先，由于它是事件驱动的药理学，已经证明靶向蛋白降解剂PROTAC分子于目标蛋白和E3的结合并不需要很强的亲和力。因此，它可能对点突变不太敏感，虽然突变会导致亲和力的显着损失，但对蛋白降解的效力影响不大。其次，类似于基因敲除，PROTACs分子可以清除目标蛋白的所有功能，包括非酶功能，其通常在病毒编码的蛋白中发现。

这里，研究者合成并验证了降解HCV的NS3蛋白的PROTACs分子。实验证明，最佳的PROTAC分子DGY - 08 -097诱导快速和持续的蛋白酶体介导的NS3降解，其与细胞感染模型中感染性HCV的抑制相关。通过定量表达蛋白质组学评估，DGY - 08 - 097对NS3具有选择性。我们证明NS3的降解是DGY - 08 - 097药理学效果的关键因素。最令人兴奋的是，实验表明DGY - 08 - 097可保留抗NS3点突变病毒的活性，从而解决了抗Telaprevir病毒的耐药性问题。

该研究确证了靶向蛋白降解是一种潜在的抗病毒药物开发的新策略。有趣的是，虽然DGY - 08 -097在体外的NS3降解试验中表现出较高浓度下活性降低的“钩状效应”（图2a），但在细胞层面的抗病毒试验中却没有观察到这种现象。这可能是由于目标蛋白丰度的差异，以及在感染性病毒测定中形成三元复合物或在较高浓度下抑制HCV的NS3 / 4A蛋白酶活性而导致，但其它PROTACs分子已在癌症的临床前体内模型中显示出该效应。尽管在体外已证明的确存在“钩状效应”，但仍需要进一步的工作来确定体内抗病毒活性的治疗窗口。虽然使用已知的配体如Telaprevir提供了方便的切入点，在开发利用非催化结合口袋的PROTAC分子领域存在令人兴奋的潜力。这将使其可以降解不具有常规可药性口袋的靶蛋白，并能使降解剂与传统抑制剂组合以开发具有持久效力的抗病毒药物。特别的是，许多病毒表达的基本蛋白，其结构数据不足以支持传统的基于结构的抑制剂设计，并且由于我们对其生物化学功能的了解有限，无法开发基于病毒靶蛋白的筛选试验。

参考文献

https://doi-org/10.1038/s41467-019-11429-w

www.prodedrug.com

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