首个降解KRAS的PROTAC

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【分迪看点】：CREWs(Arvinas公司创始人)课题组开发了首个降解内源性KRAS的PROTAC分子LC-2，能快速持续降解不同肿瘤细胞中KRAS^G12C蛋白，调节下游信号传导。

一

摘要

2020年4月10日，CREW(Arvinas公司创始人)团队在预印本ChemRxiv发表了“Targeted Degradation of Oncogenic KRAS^G12C by VHL-recruiting PROTACs”的文章，开发了降解KRAS^G12C突变体的PROTAC分子LC-2。之前已有利用PROTAC降解内源性KRAS的研究，但未对KRAS进行有效降解。LC-2能快速降解不同纯合体和杂合体肿瘤细胞中的KRAS^G12C，是报道的首个可以降解内源性KRAS^G12C的化合物。

二

背景

长期以来，KRAS因其结构一直被认为是不可成药靶点。尽管如此，部分作用于KRAS^G12C突变体的小分子抑制剂已完成 I 期临床并显示了良好的结果，但最近已有抑制剂治疗后机体产生快速自适抵抗和MAPK信号通路重新激活的报道，开发靶向降解KRAS^G12C可弥补这方面的不足。

三

结果

1.  降解活性研究

首先利用MRTX849(图1A，KRAS^G12C抑制剂，已进入I期临床试验)和VHL合成了PROTAC分子LC-1(图1A)。在NHC-H2030细胞中以浓度递增的方式处理24小时，实验数据显示在浓度1、2.5、10、25μM时形成了LC-1和KRAS的共价结合体(图1B)，但几乎未对KRAS^G12C产生降解。进一步改进LC-1分子，将Linker上易溶于水的酰胺基团去除并优化Linker碳链长度，从分子库中筛选出最优的PROTAC分子LC-2(图1A)用于研究。LC-2在浓度为2.5μM时对NCI-H2030细胞KRAS^G12C的DMax > 75%，DC₅₀为 0.59 ± 0.2μM(图1C)。LC-2在10μM浓度时产生了“钩效应”，这是由于PROTAC与靶蛋白KRAS^G12C或者泛素连接酶VHL产生了二聚体，阻碍了三聚体的形成。

图1 MRTX849-VHL PROTAC降解NCI-H2030中内源性KRAS研究

在HCT116细胞(带KRAS^G13D突变)中，未发现LC-2对KRAS^G13D产生结合或者降解，即使浓度达到10μM(图2)，这说明LC-2只选择性结合并降解KRAS^G12C突变蛋白。

图2 LC-2降解特异性研究

此外，用LC-2处理5个不同的细胞系(都带KRAS^G12C突变且对抑制剂MRTX849敏感度不同)，试验结果DC₅₀值在 0.25 - 0.76μM，DMax > 75-90%(表1)，这说明LC-2能降解对MRTX849敏感度不同的纯合体和杂合体细胞系中KRAS^G12C突变蛋白。

表1 LC-2在不同肿瘤细胞中降解内源性KRAS活性研究

2.  降解机制研究

接下来，进行了降解机制研究。合成并使用LC-2 Epimer(图1A)作为负对照(和LC-2的理化性质相同但不结合VHL)。在NCI-H2030细胞中用2.5μM浓度LC-2 Epime处理4小时，结果只观察到了与KRAS的结合物(图3A)，并未产生有效降解；随后在LC-2处理NCI-H2030之前用过量的VHL配体处理，结果降低了KRAS的降解；此后用1μM的MLN4924(抑制结合VHL活性)和Epoxomicin(抑制蛋白酶体活性)预先处理NCI-H2030细胞，然后分别加入2.5μM的LC-2，结果抑制了LC-2的降解活性(图3A)；最后用BafA1(溶酶体抑制剂)预处理NCI-23细胞结果不能抑制LC-2降解活性(图3B)。以上试验结果说明降解是通过形成KRAS-PROTAC-VHL三元复合物进行的。

图3 LC-2对KRAS降解机制研究

3.  降解动力学研究

随后进行了LC-2降解动力学研究。在NCI-H2030和SW1573中使用2.5μM浓度的LC-2处理细胞，LC-2 Epimer做负对照（用于区别结合和降解）。结果显示，在NCI-H2030细胞中，在LC-2和LC-2 Epimer中观察到KRAS复合物第1小时就开始形成(图4A)，最大结合和有效降解发生在4小时以内，最大降解发生在8小时并持续到24小时。在SW1573细胞中，显示了更快的动力学，最大结合在1小时就产生，但直到12小时才发生最大降解，降解速度低于NCI-H2030细胞(图4B)。

图4 LC-2对KRAS降解速度研究

此后验证了降解持续性。使用MIA PaCa、NCI-H23、SW1573细胞，用2.5μM的LC-2分别处理6、24、48、72小时。在所有细胞中，最大降解在24小时内发生，并且持续到72小时(图5AB)。在NCI-H23细胞中，KRAS在72小时开始上升。以上数据表明LC-2在纯合体和杂合体细胞中均能够快速、持续的降解KRAS。

图5 LC-2对KRAS降解持续性研究

4.  降解对信号传导的影响及动力学研究

此后在NCI-H2030和NCI-H23细胞中研究了LC-2调节Erk信号传导能力，所有细胞以不同浓度LC-2分别处理24小时。在NCI-H2030中，发现pErk以剂量依赖方式降低(图6A)，总Erk以剂量依赖的方式升高。在NCI-H23细胞中也观察到如上的结果(图6B)。

图6 KRAS降解对Erk信号通路影响研究

最后利用2.5μM的LC-2浓度分别处理MIA PaCa、NCI-H23、SW1573细胞进行24小时信号传导动力学研究。在MIA PaCa、NCI-H23细胞中，用MRTX和LC-2处理6小时内信号都发生了缓和，且在6和24小时都抑制了pErk水平(图7AB)。在SW1573细胞中，pEkr在1-4小时内被抑制，8-24小时之间回升。数据可以看出LC-2处理的pErk水平显著低于用DMSO处理，总Erk水平一直增加且高于DMSO。这些研究数据表明，LC-2引起的KRAS^G12C降解能调节下游信号传导，并且抑制和降解对信号传导的影响和细胞系有关。

图7 KRAS降解对信号传导影响动力学研究 

四

讨论

之前已有利用PROTAC降解内源性KRAS的研究，但所开发PROTAC分子未对内源KRAS产生降解，其PROTAC分子基于抑制剂ARS1620并利用沙利度胺招募CRBN构建。本文开发的PROTAC分子LC-2基于MRTX849(已进入临床且对靶点有高度选择性)和E3泛素连接酶VHL构建。试验结果说明只要找到合适的配体，就能降解KRAS。此外，因影响轮回催化作用，利用PROTAC的共价结合可能限制其效力，因此，开发针对KRAS突变体的可逆PROTAC是必要的。尽管有其局限性，但LC-2的发现为癌症治疗中靶向KRAS突变体开辟了新的机会。

   参考文献   

doi.org/10.26434/chemrxiv.12091176.v1

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END

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