火视247| QX200™微滴数字PCR系统：临床应用的PCR超新星

摘要

以QX200™为代表，新一代的微滴数字PCR系统由于反应成本低、结果精确、不受扩增效率影响等优势，应用范围比qPCR更广，在临床应用方面将有更大发展空间，再加上实力雄厚的老牌生物技术公司Bio-Rad，发展潜力巨大，值得关注。

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德国柏林50岁的Timothy Ray Brown先生曾是一位艾滋病患者，但得益于Sangamo BioSciences公司Gary Lee博士团队的基因治疗技术和Bio-Rad公司的微滴数字PCR技术，他的艾滋病已经被确认治愈。

微滴数字PCR系统即Droplet Digital™ PCR系统（ddPCR），它的出现使得靶分子定量检测达到了前所未有的灵敏度和精确度。它的开发基于美国QuantaLife公司的绝对定量PCR技术，该公司成立于2008年。2011年10月QuantaLife公司被生物技术巨头公司Bio-Rad正式收购。

公司信息

Bio-Rad公司始由 David Schwartz 先生和他的妻子化学家Alice Schwartz 于 1957 年创建，总部位于加州 Hercules。 经过40年的不断开拓与发展，公司持续保持健康的年销售增长率和利润率,现在已发展为世界临床诊断和生命科学领域屈指可数的高科技跨国公司之一。Bio-Rad公司的产品主要分布在生命科学和临床诊断两大领域。

根据产品的不同，公司下设三大部门，它们是生命科学部，临床诊断部和工业材料部，产品种类达6000余种。主要产品有蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品、基因枪与电穿孔仪、定量基因扩增仪、图像分析系统、激光共聚焦扫描显微镜、酶标仪和洗板机系列、食品检测仪器与试剂、糖化血红蛋白检测系列产品、质控系统、毒物检测产品、血液病毒检测产品等。 

在公司四十多年的发展中，Bio-Rad向全球的生命科学研究和临床诊断领域提供了广泛的研究设备和技术服务，其技术始终处于世界的前列。其中，生命科学部名列世界排名前五名，临床诊断部名列世界排名前十名。现有30余个分公司分布于世界各地，悉心服务于全球 70,000多个研究所，工厂和临床的实验室。2001年，全球的总销售额超过了8亿美元。 

进军中国

凭着日益壮大的研究和开发力量，经验丰富的员工队伍，Bio-Rad公司在该领域中，处于技术创新和不断突破的地位。Bio-Rad公司十分注重中国市场的开拓与服务。目前，在北京、上海、武汉、广州、香港和台北设立了办事处，分别配备技术支持、客户服务、维修和商务人员，一个专业化、本地化的队伍已经形成。
此外，为了给广大中国用户提供更大的便利，满足对消耗产品供货时间的 要求，Bio-Rad在上海外高桥保税区成立了独资公司---伯乐生命医学产品（上海）有限公司，同时，为公司将来在中国设厂生产提供了基础，从而谋求更大的发展。 

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Bio-Rad主要产品包括：各类电泳产品、定量及定性PCR产品、基因突变分析产品、凝胶成像系统、蛋白质组学研究系统、蛋白纯化平台及各类相关试剂耗材。我们本篇着重介绍一下其最新产品：QX200™微滴数字PCR系统。
QX200™微滴数字PCR系统是QX100™的升级版。这种新PCR系统建立在油包水微滴生成技术上，可用于实验室研究、临床诊断和CDC病原体检测等领域，为研究人员提供了检测罕见突变、区分肿瘤中罕见序列、精确测量拷贝数变异、基因表达绝对量化的新工具。
QX200 Droplet Digital PCR 系统的创新之处主要在于微滴技术，技术载体是微滴生成仪和微滴分析仪，其操作步骤简单，具体如下：

Step 1使用微滴生成仪将含有DNA或RNA的PCR反应体系分成约20,000 个纳升大小的微滴。
Step 2使用热循环仪让微滴进行PCR；经过PCR的微滴，除了定量分析外，还可用于测序或克隆等。
Step 3使用微滴分析仪对微滴逐个分析；乳化的微滴通过管路时被分解，之后它们依次通过一个双色光学检测系统，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，系统将根据泊松分布调整计算阳性和阴性微滴数量，从而以数字格式对靶分子绝对定量分析。

这种PCR系统的优点在于微滴划分功能可减少扩增效率和PCR抑制剂的影响，每次可运行 96 个样品而且可灵活扩展，操作方便且不需要标准曲线就可获得比qPCR更精确的定量结果。

癌症标志物的精准检测

微滴数字PCR在临床应用方面，不仅可以检测出病毒DNA，还可以检测癌症标志物。

以骨髓细胞瘤病致癌基因和β球蛋白从 CN1 到 CN13 的拷贝数为例（CN代表拷贝数），利用QX200 系统检测，下面图A中的二维荧光强度图显示了 CN6 样品骨髓细胞瘤病致癌基因与β球蛋白双重检测方法的复孔。图上的黑色聚类表示阴性微滴，绿色聚类表示MYC 阳性微滴，蓝色聚类表示HBB 阳性微滴，橙色聚类表示对 MYC 和 HBB 均为阳性的微滴。


图B拷贝数图显示了CN1到CN13样品的精确复孔值。

基因测序方面，QX200™微滴数字PCR系统应用于二代测序技术（NGS）中时，测量结果可以发现错误连接片段、过长连接片段等信息，验证单核苷酸多态性，突变及拷贝数变异在内的基因组变异，能更好确保文库上样量的准确性，提高 NGS的运行效率与数据质量，确保测序结果的可信度。

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PCR在液体活检中将发挥不可替代的重要作用。

☆ 数字化PCR法是核酸分子的绝对定量技术，已有研究显示，对血浆样本EGFR突变检测的敏感性高达91.7%。

☆  数字PCR既能定量、也能定性，其检测基因突变的特异性高。
☆  YOSHITAKA SEKI等报告（Oncologist 2016，21:156–164），T790M突变状态在ctDNA与再活检肿瘤组织之间的相似率为0.8，敏感性为71%；T790M突变cfDNA片段随着治疗发生变化，并且在对TKI产生获得性耐药的患者之间也不同。Oxnard GR等报告［ Clin Cancer Res 2014 Mar 15，20(6):1698-705］，通过微滴数字PCR（ddPCR）动态监测敏感和耐药EGFR突变，具有高敏感性和精确的定量结果（如上图）。
☆ BEAMing数字PCR检测是结合了磁珠法乳浊液扩增和流式细胞术的一项技术，灵敏性高（可达0.02%），而且能对肿瘤DNA分子突变进行定量。

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