HILIC在生物样本分析中的应用

生物样本（如血清、血浆、全血、尿、粪等）分析对于药物和制剂研发非常重要，如对于药物药代学和药效学的研究，同时在临床方面也有很广泛的运用，如临床内分泌、遗传性代谢缺陷筛查、毒物和滥用药物筛查、法医鉴定和兴奋剂检测等。亲水作用色谱（Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）的物质保留和RPLC的不同，适合于极性化合物的分析，可以作为RPLC的补充，已经越来越广泛地用于生物样本分析。本文就HILIC在生物样本中的应用作一些简单讨论。

生物样本的特点是：①生物样本基质组成非常复杂，既有大分子的蛋白质、核酸，也有小分子的脂肪、糖、尿酸和无机盐等，这些都可能导致对目标分析物的干扰；②生物样本的分析物浓度都比较低，有的代谢产物的浓度非常低，需要较高的灵敏度；③相对来说，生物样本比较脏，容易造成色谱柱堵塞和离子源污染等。

HILIC是正相色谱（NPLC）的变体，但区别于正相色谱，HILIC的洗脱方式和NPLC类似，但使用的是反相溶剂系统（有机溶剂-水溶液），所以有“正相反用”的说法。HILIC所用的固定相是极性的，通常为未衍生化硅胶或者键合酰胺基、氨基、二醇、两性离子等，可以轻易吸附水及其他极性溶剂。HILIC的保留机制是液-液分配、吸附、离子相互作用和亲水性保留的多模式组合。主导的分配机制是基于相似相容的原理，极性化合物更容易保留，水在HILIC中是最强的洗脱剂。这样HILIC模式更适合于极性药物和代谢产物的分析。而由于HILIC的洗脱程序是和RPLC相反的，高比例的有机相更容易汽化和脱溶剂，使得目标分析物有更高的灵敏度。

HILIC用于生物样本分析的前处理：

生物样本由于基质复杂，必须要经过前处理才能进行LC或LCMS的分析，生物样本的前处理有蛋白沉淀、液液萃取和固相萃取等，蛋白沉淀前处理简单快速，但不能完全去除掉无机盐、磷脂、糖等的影响。通常所用的蛋白沉淀试剂有①与水混溶的有机试剂，乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃等；②中性盐，饱和硫酸铵、硫酸钠等，使蛋白脱水而沉淀；③强酸：10%三氯乙酸、6%高氯酸等；③锌盐、铜盐等，金属阳离子与蛋白羧基形成不溶性盐而沉淀；④酶，用于测定酸不稳定及蛋白结合的化合物

液液萃取法相对蛋白沉淀来说，可以减少基质效应，但对于极性化合物回收率低，且步骤比较繁琐。液液萃取可以使用二氯甲烷、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等，也可以使用混合溶剂。另外可以添加与水混溶的溶剂，同时添加高浓度的盐，增加水相的极性，促进两相的分离，这种叫盐析复杂液液萃取（SALLE）。

固相萃取法（SPE）的方法灵敏度高，选择性强，但成本高。SPE可以实现除杂质、脱盐、使复杂基质生物样品得到净化，文献也有报道通过SPE前处理，对比RPLC和HILIC分析，HILIC分析更能减少基质效应。

HILIC用于生物样本分析的色谱条件：

上述的前处理方法都会使用高比例的有机相，尤其是液液萃取和固相萃取通常还需要氮吹除去溶剂再用流动相复溶，但HILIC模式可以省略这一步，在HILIC模式下通常都是高比例的有机相，但水相的比例不应低于3%。在HILIC模式下，溶剂的洗脱顺序由弱至强为：丙酮乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水。

溶解样品溶剂，尽量使用高比例的有机相，由于水在HILIC模式下是强的洗脱剂，进样样品中水相比例高会导致化合物保留差，如图一所示。小分子化合物首选的是乙腈，纯乙腈溶解不好是可以用乙腈/异丙醇（50:50，V/V）代替。对于多肽的分析，可以使用异丙醇或乙醇来代替乙腈来防止多肽变性集聚。

Figure1.样品溶剂中水相比例对次黄嘌呤（80g/ml）、胞嘧啶（10μg/ml）、烟酸（30μg/ml）普鲁卡因胺（30μg/ml）色谱峰形的影响。色谱条件：Acquity BEH HILIC（2.1*150mm，1.7μm），flow rate：0.5ml/min，λ= 214 nm, injection volume: 5μl,gradient profile: 95% ACN for 6 min, 95-75%
ACN in 5 min

用于生物样本分析的HILIC的固定相大部分使用的是非衍生化硅胶和两性离子（ZIC）。典型的两性离子固定相是黄烷基三甲铵乙酯固定相，这种固定相最典型的特征是相互平衡的永久性表面带电电荷，可同时提供带正电和负电荷的官能团。

基质效应：

基质效应主要发生在离子化步骤，在ESI源下，来源于样品的的盐类、离子对试剂、磷脂和蛋白质等都会导致基质效应，反相色谱中通过色谱分离很难去除掉磷脂的影响，同时由于磷脂在RPLC中强保留，高通量的样品检测后会累积在色谱柱上。但磷脂在HILIC色谱柱上不保留，这样就降低了磷脂的干扰。

生物样本分析在新药研发和临床检测有着很重要的作用，LC-MSMS对于复杂基质中药物的检测具有高灵敏度和高特异性的优势，HILIC作为RPLC的补充，非常适合于极性化合物和代谢产物的分析，同时HILIC的流动相系统和RPLC是一致的，这样可以将HILIC和RPLC联合使用来用于复杂的生物样品分析。

参考：

1.Eric S.Grumbach，Kenneth J.Fountain.HILIC综合指南

2.  李水军.液相色谱-质谱联用技术临床应用

3. E Areseniuk.Recent advances in the application of hydrophilic
interaction chromatography for the analysis of biological matrices[J].Bioanalysis
,2015,7(22):2927-45.

4.   Lucie Havlíková, HanaVlčková, Petr Solich & Lucie Nováková HILIC UHPLC–MS/MS for fast and sensitive bioanalysis: accounting for matrix effects in method development[J]. Bioanalysis,2013, 5(19), 2345–2357.

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