色谱分析常用定量方法
色谱定量分析，顾名思义就是色谱分析方法来测定组分的含量，主要分为面积百分比法、归一化法、外标法、内标法和标准加入法，色谱定量分析首先需要明确的概念是响应因子，不同的化合物在检测器的响应是不一样的，简单地举个例子说，相同浓度的化合物A和B，相同的进样量，得到的峰高和峰面积不一定一样的，响应因子的计算式如下：
式中，w为化合物的含量，A为响应值，一般为峰面积或峰高，本文以峰面积为例。由于不同的化合物在同一个检测器的响应因子不同，甚至同一个化合物不同浓度在同一检测器的响应因子不同，简单地说就是化合物在检测器的响应不呈线性，或者线性范围比较窄。选择合适的定量方法时，除需要考虑是相对定量还是绝对定量外，同时需要考察化合物的线性响应范围、是否有合适内标、是否有标准品等。本文简单介绍下色谱分析中常用的一些定量方法。
1. 归一化法：
把所有出峰的组分含量之和按100%计算的定量方法，其中组分i的质量分数可按下式计算：
式中，f为响应因子，A为峰面积，w为含量
归一化法属于相对定量，优点是简便、准确，进样量、流速、柱温等操作条件对定量结果的影响小，但要求所有组分都流出色谱柱，并被检测器检出，同时需要测定各个组分的响应因子，而各个组分的响应因子的测定都需要基准物质，所以使用受到限制。归一化法主要用于GC，因为GC的一些检测器如FID对某些组分的响应因子相近或有一定的规律，可以在文献上查到，当响应因子相近时，可以直接用面积归一化法。
2.峰面积百分比法：
峰面积百分比法也是相对定量，忽略各个组分的响应因子或者默认为每个组分的响应因子相同，计算如下式：
峰面积百分比法适合于不需要准确定量，同时难以得到响应因子的情况。
3.外标法：
外标法有标准曲线和单点外标法，标准曲线法是用标准品配制一系列浓度的标准溶液样品，通过不同浓度的标准溶液及其对应响应值，绘制样品浓度和响应值关系曲线：
将待测组分的响应值带入工作曲线可以计算组分的含量。
单点外标也叫标准品比对法，是将原点和标准溶液的数据连成一条直线，如下式的计算：
式中，Ci为待测组分含量，Ai为待测组分的峰面积，Astd为标准溶液中标准物的峰面积，Cstd为标准溶液浓度。
外标法属于绝对定量，绘制好标准曲线后，测定该组分的峰面积或峰高后，代入标准曲线就可以计算得到含量，待测组分含量应该是在标准曲线浓度范围内的，HPLC定量比较多使用外标法，外标法需要每次样品分析的色谱条件尽量一致，否则需要重新测定标准曲线样品得到新的标准曲线。一般一个分析批至少需要一条标准曲线，生物样品分析时除需要考察标准曲线线性范围、分析准确度和精密度外，还需要考察一个分析批能够耐受的样品数量，即在一个分析批内多少样品数量范围内定量是准确的。
4.内标法：
内标法是选择合适的化合物作为待测组分的参比物，定量地加到样品中，根据待测组分和内标的响应值（峰面积或峰高）之比，以及内标物的含量来计算待测组分的含量。
式中，fi和fIS分别为待测组分和内标的响应因子，Ai和AIS为待测组分和内标的响应值，wi和wIS分别为待测组分含量和内标含量。
这种方法需要测定待测物和内标物的响应因子，常用于GC中。另一种内标比对法是常用于LCMS/MS中，内标比对法是在不知道响应因子的情况下的一种内标法，先将一定量的内标物加入到标准物溶液中，再将相同量的内标加入到待测溶液中，分别进样，按下式计算待测组分含量：
式中，Ci为待测组分含量，Ai为待测组分的峰面积，Astd为标准溶液中标准物的峰面积，Cstd为标准溶液浓度，AIS为内标的峰面积。。
内标物的选择是内标法的关键，内标物应满足以下几点：
待测样品中不存在
不与待测物起反应，不干扰待测物的响应
尽可能与待测物性质相似，尽可能与待测组分出峰时间相近但要保证与其他组分的峰分离开，LCMSMS分析方法时尽可能选择同位素内标
内标物加入的量应与待测组分含量接近
内标物应该是稳定的纯物质
内标法的优点是：进样量的变化，色谱条件的微小变化对定量结果的影响不大，同时也可以校正样品前处理（提取、浓缩、衍生化等）过程中样品的损失。如果可以选择合适的内标，内标法定量的准确度和精密度是优于外标法的。
5.标准加入法：
标准加入法实质上是一种特殊的内标法，是以待测组分的纯物质作为内标，加入到待测样品中，然后在相同的色谱条件下，测定加入前后待测组分的峰面积（或峰高），从而计算出样品中待测组分的含量。以峰面积计算方法为例，标准加入法的计算如下：
式中，Δwi为加入的标准品的量，Ai为待测组分的峰面积，ΔAi为加入标准品后待测组分峰面积的增加量，wi为原样品中待测组分的含量。
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