粒度分布方法学验证的可接受标准
药事纵横在2018年01月03日发表了“粒度分布测定方法开发策略——湿法”一文，作者介绍了湿法开发中的注意事项。在2018年03月05日发表了“粒度分布测定方法开发策略——干法”一文，介绍了干法开发中的注意事项。
今天本文通过具体案例系统介绍如何进行粒度测定方法学验证，通过本案例可以为方案的起草提供思路。
方法验证的目的是通过测试会造成粒径结果差异的所有可能参数，以确定方法的稳健性和完整性。FDA将验证定义为“建立文件证据，提供高度的保证，确保特定的过程能持续生产符合其预定规格和质量属性的产品”
1、软件的验证
定期进行测试以确认其性能（IQ / OQ（至少每年一次）。软件是经过验证的软件，应符合CFR211 Part 11的规定。本文将依次考虑每个主要变量。
2、方法的验证
（1）取样
对于粒度测定，第一步就是如何取出具有代表性的样品。从表1中可以看出，不同取样方法是有很大差异的。
Riffling法最适合自由流动的粒子，但如果要处理大量的粉末，可能需要很长时间。如果样品是悬浮液，那么这会带来一系列的问题。而粉末，在运输过程中导致堆顶部的大颗粒和在底部的细粉，悬浮液将会相反。大颗粒必须充分混匀。使用某种搅拌器（特别是磁力搅拌）可能会导致大颗粒被抛到容器的外部而不能被取到。
（2）样品制备
样品制备为“以有意义的方式将样品预处理和进行测量的技术”。样品分散时，任何情况下，分散介质，空气（用于干法分散）或液体都不应对颗粒造成不可逆的改变（如溶解或聚集）。整个样品制备过程时方法开发的一部分，而不是验证。
（3）范围
理论上仪器的检测范围应覆盖样品的粒子范围，对于范围在20nm-2000μm之间的粒度仪来说，对于大多数药物样品的检测没有问题。
（4）专属性
在粒度分析中没有严格的要求来进行这个测试。适当的技术应该在方法开发中建立。当然，不同的粒度分析方法可能会导致同一样品的不同结果。另外，对于激光粒度检测，很难开发一种能区分制剂内中不同组分的粒度分析方法。在悬浮液的情况下，可能需要配制空白混合物并分开分析。
（5）耐用性
分析方法的耐用性表明其能够保持不受测试参数的微小变化的影响，从而在日常使用中保证其可靠性。在进行重复性，重现性和中间精密度测试之前，应考虑方法的耐用性。
通常考虑的变化是测量持续时间和测量稳定性的变化。干法测量的气压和湿法测量的泵/搅拌速率的变化是方法开发的重要部分，通常在这里可以简要提及。
a）测量时间
这个测试的目的是确定一个合适的测量持续时间，然后用于重复性，重现性和中间精密度测试。
样品应按照所研究的方法进行制备。10次测量的周期应该持续2，5，7，10和15秒的时间。应记录每个时间的单个数据和平均数据。结果可以绘制成图。可以通过中值粒度的相对标准偏差来选择适当的持续时间。对于中值粒径[D(v，0.5)]大于10μm的粒子，相对标准偏差（RSD）应小于3%；中间值粒径小于10μm的粒子的RSD必须小于6%。这反映了一个事实：即较小的颗粒越难分散。
可以看出RSD随时间增加，因此选择RSD低（5秒）的中间点进行测量。从总体数据看，可以推断2秒是不够的，因为它似乎没有给予较大的粒子足够的时间进行采样，所以D（v, 0.5）明显较低。
b）重复性/样品测量稳定性
为了确定样品在分析过程中是否稳定且不发生团聚，解聚或溶解，有必要在已知时间点监测粒度分布。
样品应按照所研究的方法进行制备。建议在初期建立的时间内至少进行五次测量。测量可以在1、3、5、7和10分钟后进行。应在每个时间点至少进行五次重复测量。然后应确定D（v，0.1），D（v，0.5）和D（v，0.9）值的平均值和相对标准偏差。
对于D（v，0.5）大于10μm的物质，当满足下列条件时，可接受的时间点标准：D（v，0.5）RSD 小于3%，D（v，0.1）和D（v，0.9）RSD小于5%。
对于D（v，0.5）小于10μm的物质，当满足下列条件时，可接受的时间点标准为：D（v，0.5）RSD小于6%，D（v，0.1）和D（v，0.9）RSD 小于10%。
这反映了较小的颗粒更难分散的事实。这些是ISO13320中规定的可接受性的标准，许多样品应该很容易达到更低的RSD。
从上述结果可以清楚地看出，乳糖样品在悬浮状态下是稳定的。从这些结果可以确定，1分钟后应进行测量，以使样品时间达到平衡。
c）气压（干式测量）/超声波（湿式测量）
作为方法开发的一部分，应先进行压力确定（见ISO 13320第6.2.3.2节）。合适的压力使颗粒分散，但不发生颗粒减小。大多数药物是易碎的，如果压力太高，将在进料器被研磨成粉。分散和研磨通常同时发生（导致分布变宽）。通过在不同的压力下测量相同数量的样品（理想地通过旋转切割器采样到单一粒径），可以确定在没有研磨的情况下达到最大分散时的压力。证明没有发生研磨的最好方法是湿和干分散，获得几乎相同的结果。
由上图可见，1 bar的压力不足以材料分散。只要压力大于2 bar，就可以获得好的结果。
ISO 13320建议使用超声波辅助分散，过多的超声波会击碎的药物颗粒，尽管这是极不常见的。作为方法开发的一部分，应该测试改变超声波的持续时间和功率对粒度分布的影响。理论上，应在超声波检查之前，期间和之后分别进行测量，以检查声波处理对测量的耐用性有何影响。除了分离颗粒之外，超声波还可以增加颗粒-颗粒碰撞的速率，实际上还可能导致聚集。
d）泵和搅拌速率
测量过程中使用的泵和搅拌速度应作为方法开发的一部分进行测试。所选择的条件应该能够在不引起夹带空气的情况下悬浮所有物质（如果使用表面活性剂则是特别的问题）。
图3显示了根据搅拌器设置，乳糖样品结果的变化。可以看出，2000rpm以上时结果达到稳定。正是在这一点上，所有的物质正确地悬浮和分散。搅拌速率在2000rpm以下时，样品沉降导致结果比预期小。
e）折射率选择的确认
折射率的选择应该作为方法开发工作的一部分。可以使用折射率匹配流体来提供真实折射率的实验证据。
（6）线性
遮光是样本散射的光量的量度。对于给定浓度范围内的大多数粒度分布，粒度应与浓度无关。在极低的浓度下，由于可能获得大的RSD（由于高信噪比）并且在极高的浓度下，由于多次散射，结果可能会比预期的要小。建议使用测量持续时间相同的测试方式研究5%，10%，15%，20%和25%的遮光，同样制订可接受的RSD。
（7）重现性
重现性实验室间精确度的指标。它确实可以证明这一点，更有可能表明取样的有效性。它也可以用来标记不同仪器之间的差异（无论是相同的还是不同的型号）。应从同一批次中抽取多个样品（至少五个），并按照该方法进行测试。
在研究中，对于每个样品，应至少进行五次重复测量，并获得单个和平均结果。
根据五次重复测量的平均结果，对于所有取样的样品，应该确定D（v，0.1），D（v，0.5）和D（v，0.9）的RSD。对于D（v，0.5）大于10μm的物质，如果D（v，0.5）RSD小于3%，D（v，0.1）和D（v，0.9）RSD小于5%，则说明具有良好的重现性。对于D（v，0.5）小于10μm的物质，如果D（v，0.5）RSD小于6%，D（v，0.1）和D（v，0.9）RSD小于10%，则说明具有良好的重现性。这些也是ISO 13320规定的标准。
此处采用勺取样，相对标准偏差与表1中的相符。
（8）中间精度
方法的精确性的测定应通过第二个分析员或第二个仪器（或两者）来完成。 这实质上应该是重复进行重复性的测试。D（v，0.5）在第二次测试中的RSD应该小于3%。然后将两组结果合并为一个汇总平均值和一个汇总的RSD（应小于3%）。
这里的数据RSD小于3％，显示中间精度结果可接受。
检测限和定量限的验证术语不适用于激光粒度方法，因此不在本文的范围内，取决于相关的仪器。
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排版：梅希
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