PRONEU：彭长庚课题组发现全新止痛靶点以及靶向钠离子通道止痛药物研发的新思路
同济大学脑与脊髓临床研究中心研究员彭长庚团队，在《Progress in Neurobiology 》杂志发表研究论文“MicroRNA-96 is required to prevent allodynia by repressing voltage-gated sodium channels in spinal cord”。
敲除miR-96的一个等位基因就会导致小鼠异常机械痛和热痛。
miR-96抑制电压门控钠离子通道Nav1.7, 1.8, 1.9和1.2和钙离子通道CACNA2D1/2。
首次发现Nav1.7和Nav1.8参与中枢敏化，改写靶向钠离子通道止痛药物的研发思路。
神经病理性疼痛是一种难治的慢性疼痛，流调显示欧洲有7%-8%的人群受神经病理性疼痛影响[1]。目前临床上一线使用的治疗神经病理性疼痛的药物如普瑞巴林和加巴喷丁等都只能缓解40-60%神经病理性疼痛患者的疼痛[2]。因病机复杂和对其了解不足，近20年无新药上市。因市场缺少好的神经病理性疼痛药物，美国NIH把疼痛研究列为五大神经研究方向之一。
电压门控钠离子通道由α和β亚基组成，在疼痛感知中扮演非常重要的角色。在人和小鼠中缺失或突变电压门控钠离子通道Nav1.7或Nav1.8会丧失痛感或造成异常疼痛，因此Nav1.7和Nav1.8被认为是很好的镇痛靶点[3，4]。阿斯利康、礼来和辉瑞等大的国际医药公司投入重金以Nav1.7和Nav1.8为靶点开发治疗神经病理性疼痛的药物，目前尚未成功。
微RNA（microRNA）在机械感觉阈值和神经病理性疼痛中起重要的作用。之前彭长庚研究员在瑞典卡罗琳斯卡Patrik Ernfors院士实验室做博士后研究员时发现miR-183家族（miR-183-96-182）在背根神经节中通过调控神经病理性疼痛基因网络中包括临床药物靶点CACNA2D1/2和核心转录因子在内的80%的基因来抑制神经病理性疼痛【5】，回国后彭长庚研究员建课题组继续深入研究miR-183家族的功能，2018年阐明miR-183家族通过调控Shox2的表达时间窗来控制TrkB和TrkC感觉神经元分化数目比例【6】，而TrkB感觉神经元是彭长庚博士首发现的在神经损伤时才参与疼痛感知的神经元种类，是治疗神经病理性疼痛应该需靶向的细胞【5】。
近日彭长庚课题组在发表miR-96抑制机械痛敏的分子机制。作者们首先利用Crisp/Casp9技术制备只敲除miR-96，而不影响miR-183和miR-182的小鼠，结果意外发现miR-96 KO纯合子小鼠的机械疼痛阈值非常低，相当于坐骨神经选择性切断（Spared nerve injury,SNI）小鼠的异常机械疼痛（mechanical allodynia）的阈值，而且杂合子小鼠的阈值与纯合子一样低（图1A）。同时miR-96 KO对热痛也异常敏感，但小鼠的冷痛和伤害性刺痛阈不受影响（图1B，C）。
图1
因miR-96 KO小鼠的表型比在背根神经节（DRG）中敲除miR-183-96-182的表型要严重很多，也知miR-183-96-182在脊髓中表达【5】，作者推测脊髓中丢失miR-96是表型更严重的原因。为了证实此推测，作者首先用中等硬度的毛刷戳压小鼠的脚掌，发现脊髓中被非伤害性机械刺激激活的神经元（Fos+）数目显著增多(图1G-I)。脊髓RNA-seq揭示电压门控钠离子通道网络Nav1.7，Nav1.8，Nav1.9和Nav1.2的表达升高。之前公认Nav1.7和Nav1.8在脊髓中不表达，大公司研发不透血脑屏障的Nav1.7的抑制剂止痛药物。
KOHOMO response to 0.4g filament
紧接着，作者用原位杂交、免疫荧光和Western-blot三种方法严谨地证实了敲除miR-96后导致Nav1.7和Nav1.8异常在脊髓神经元中表达（图2），鞘内注射不透血脑屏障的Nav1.7的抑制剂或Nav1.8的抑制剂都能显著缓解miR-96 KO小鼠的异常机械疼痛，这些证明了异常表达的Nav1.7和Nav1.8参与中枢敏化。
图2
进而作者制备了miR-96LacZ和miR-96GFP两个报告小鼠系，证明miR-96在髓神经元中表达，未检测到在疼痛感知相关脑区有表达，且70%的GFP/miR-96表达的脊髓神经元是GABA神经元（图3 C-F）；而且戳脚后，Fos阳性神经元中显著增加的也是GABA类神经元。
图3
为了研究miR-96在DRG之外对机械阈值的贡献大小，作者构建了GAD2：：CreERT2敲入小鼠，Tomaxifen诱导后标记脊髓背角GABA神经元，不标记DRG神经元。作者用GAD2：：CreERT2小鼠与制备的miR-96 Flox小鼠交配得到GAD2：：CreERT2；miR-96 CKO小鼠,在成年后注射Tomaxifen诱导在脊髓GABA神经元中敲除miR-96，GAD2：：CreERT2；miR-96 CKO小鼠复制了miR-96 KO的痛敏表型，原位杂交、免疫荧光和WB检测证实Nav1.7，Nav1.8，Nav1.9和Nav1.2的表达在脊髓中异常升高（图4）。而且戳脚后脊髓中Fos阳性神经元显著增多，鞘内注射Nav1.7或Nav1.8抑制剂能逆转表型，表明敲除miR-96后脊髓神经元确实是敏化的。
图4
为了研究miR-96在神经病理性疼痛中的功能，作者制备了SNI小鼠模型，RT-PCR检测发现SNI手术2周后miR-96在脊髓中的表达显著下降，在4周时也未恢复。用miR-96GFP报告小鼠检测发现SNI手术2周后miR-96在脊髓背角GABA神经元和兴奋性神经元中都显著丢失。RT-PCR检测发现miR-96的表达与Nav1.7，Nav1.8和Nav1.2成负相关，免疫荧光染色发现Nav1.7，Nav1.8和Nav1.9在脊髓中表达升高，且鞘内注射Nav1.7或Nav1.8抑制剂能显著地缓解神经病理性疼痛。
本文利用详实的数据证明miR-96通过抑制电压门控钠离子通道和钙离子通道网络来阻止机械敏化，表明miR-96是潜在的治疗神经病理性疼痛的靶点（图5）。因首次发现脊髓神经元在神经损伤时异常表达Nav1.7和Nav1.8，表明钠离子通道抑制剂可能需要透血脑屏障才能达到最好的止痛效果，改写靶向Nav1.7和Nav1.8镇痛药物研发的策略。
图5
更值得一提的是该文章的审稿意见和作者的答复意见也都随文章发表了。评委对文章高度评价：
Reviewer #1
This is an interesting study that uses a number of techniques that provide evidence for an important role ofmicroRNA-96 in pain processes.
An important finding is that sodium channels on spinalneurons appear to be important and this has major implications for the design and assessment of novel analgesics.
Reviewer #2
The large amount of data presented in this manuscript was obtained using a variety of methods and resulted in the identification of miR-96 as a possible target for pain treatment.
作者对评委提的修改建议和意见逐点回复，让所有的评委都满意，其中一个评委认为“The authors have made an excellent response to the reviewers comments”.
该研究论文的一作者是爱丁堡大学毕业的孙立婷博士，博士研究生夏瑞龙是共同一作者。该工作受国家自然科学基金委(31741057, 31871063, 51971236, 32070977) 和国家科技部(2018ZX09733001-006-005)项目的资助。
参考文献
1. Bouhassira D, et al. Rev Neurol (Paris). 2014 Nov;170(11):703-11.
2. Finnerup NB, et al. Lancet Neurol. 2015 Feb;14(2):162-73.
3. Cox, J.J., et al. Nature. 2006. 444, 894-898.
4. Duan, G., Mol Pain. 2016. 12.
5. Peng C, et al. Science. 2017 Jun 16;356(6343):1168-1171.
6. Peng C，et al. Development. 2018 Sep 25;145(18):dev165613.
来源：brainnews及彭长庚研究员课题组