专题详解 | 五大类先进疗法产品（ ATMP）及其外源因子检测控制策略
随着医药和治疗技术的不断进步，当代医学正发生着迅猛的变化，逐渐从分子治疗迈入细胞治疗、基因治疗、组织工程、溶瘤病毒等先进疗法产品（ ATMP）时代。
ATMP是利用患者自体（或异体）细胞、组织或基因制备而成的药物（疗法），代表了医学新趋势，也为广大患者带来了更多新的机会。最近，由于 ATMP在癌症、神经退行性疾病等不治之症方面的临床疗效取得突破性进展， ATMP已经成业界广泛关注的热点。
由于 ATMP的生产工艺与传统生物制品有较大差异，且所采用的原材料、设备、设施等也不尽相同，故其外源因子的风险控制内容也有所区别。由于外源因子与产品的质量和安全息息相关，在产品研发和审评中尤其应受到高度重视。
因此，本文介绍了 ATMP及其外源因子检测与控制策略。
先进疗法产品（Advanced Therapy Medical Products，ATMP）一般是指根据新的科学发现或原理而研发的治疗产品，该概念区别于传统的或相对成熟的生物技术产品｡总体而言，ATMP属于由多尺度创新研究驱动的生物制药，这类产品主要包括基因治疗药物（Gene Therapy Medical Products，GTMP）、体细胞治疗药物（Somatic Cell Therapy Medicinal Products，sCTMP）、组织工程产品（Tissue-engineered Products，TEP）、溶瘤病毒（Oncolytic Virus，OVs）和与设备相关的组织或细胞组合疗法产品（Combined ATMP）。
图 1 先进疗法产品分类
基因治疗药物是含有重组核酸的生物源产品，具有与重组核酸序列直接相关的治疗、预防或诊断作用。将正常外源基因导入靶细胞，以之纠正或补偿因基因缺陷或异常所致疾病。一般而言，GTMP指的是通过基因转移技术将外源基因插入病人体内合适的受体细胞中，使机体表达外源基因产物以治疗疾病。此外，广义的GTMP还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。
体细胞治疗药物（sCTMP）
体细胞治疗药物是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取，并通过体外扩增、特化培养等处理而产生具有强大的特异性功能的细胞，再回输体内以达到治疗疾病的目的。
组织工程产品（TEP）
组织工程产品是再生医学的一个重要领域，其借助细胞学、工程学、材料学等方法，综合使用合适的生物相容性材料、细胞及生物活性分子构建具有全部或部分组织功能的组织模拟物，用以恢复或改善组织、器官的功能。
组织工程产品主要包括含有成纤维细胞、软骨细胞等类型细胞的组织支架或移植物，通常是由患者自体细胞和胶原蛋白或纤维蛋白支架组成的片状结构，能够被组织吸收，可用于局部软骨损伤、烧伤等组织损伤的修复，促进局部组织再生和恢复。
溶瘤病毒（OVs）
溶瘤病毒疗法是一类新的治疗药物，其通过选择性杀伤肿瘤细胞和诱导全身抗肿瘤免疫的双重作用实现抗肿瘤效果。一般而言，利用基因工程技术改造溶瘤病毒，使其失去毒性，但仍保留复制能力。将如此改造后的溶瘤病毒定向递送至肿瘤细胞以杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗的目的。
溶瘤病毒分为天然溶瘤病毒和人工溶瘤病毒两类，前者包括呼肠孤病毒、细小病毒、新城疫病毒等天然对肿瘤细胞具有特异性感染或杀伤能力的病毒，此类病毒对肿瘤细胞杀伤能力有限，易激活宿主免疫系统而被宿主清除，故难以有效控制病毒的病原性。后者即经过人为改造后具备特异性肿瘤杀伤力的甲型流感病毒、腺病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒等，此类病毒是目前临床研究中主要的病毒。
组合型先进疗法产品（Combined ATMP）
除了上述四大类外，若这些新兴的治疗产品中含有生物相容性基质、支架等作为医疗产品组成部分的医疗器械部件，则也属于 ATMP，即所谓组合型 ATMP。
如上所述， ATMP的种类林林总总，每年 ATMP类临床试验申请的项目越来越多。据统计，目前临床试验申请阶段（IND）的各类 ATMP中，申请后未获批的项目约占三到四成。对既往各类未批准的新型治疗产品存在的问题进行调研可知，除产品工艺不合理､质量研究不全面外，由于外源因子控制不全面而存在安全风险的项目所占比例较大。
图 2 ATMP生产流程示意图（以CAR-T为例）
ATMP中的外源因子
生物制品中的外源因子（Adventitious Agents），通常指的是无意中引入生物制品生产过程中的细菌、真菌、支原体/螺旋体、分枝杆菌、立克次体、病毒、原生动物、寄生虫、TSE等污染微生物。
对于大多数生物制品，主要的外源因子为朊病毒、内/外源病毒、细菌、真菌､支原体等微生物。虽然这些外源因子的形态和传染性程度各不相同，但其皆可能成为生产生物制剂生产过程中的风险。严格意义上而言，根本不可能证明生物制品中这些外源因子是绝对的“阴性”。通常情况下，通过一定灵敏度水平的检测方法进行检测，若结果表明在一定数量的生物制品中无法检测到外源因子，则认为生物制品中“不含”外源因子。
为了患者安全，需要对上述这几类外源因子进行适当的风险管理。首先，需对外源因子进行适当的风险评估，识别和评估与生物制剂中潜在外源因子相关的接触风险。国内外发布了一系列重组蛋白、血液制品等传统生物制品中病毒安全性相关的指导原则，这些指导原则一般也会涉及一些外源因子的控制理念｡
ATMP属于较为新颖的生物制品，并无足够的过往经验可以借鉴。而且，其品类繁多，形式和作用功能特殊。因此，目前尚无统一健全的ATMP外源因子控制和评估原则，故以下从药学的角度总结了一些 ATMP产品IND 阶段外源因子的安全性风险控制策略｡
总体而言，根据外源因子的主要来源、工艺流程及存储各环节的特点，在ATMP的生产过程中可能引入外源因子的因素或环节主要包括：原材料和辅料､生产工艺和过程控制､病毒清除验证､产品质量控制及放行､容器密闭系统等｡
原材料和辅料中外源因子的控制策略
与传统生物制品不同之处在于，ATMP生产工艺中往往缺少或不宜引入病毒清除和除菌过滤等操作单元。因此，应当更加注意控制原材料和辅料的外源因子风险，对开发过程中所涉及的原材料和辅料产品进行充分的安全性评估，并据此选择风险最小的原材料和辅料用于生产｡
在ATMP生产工艺中，首先需对起始原材料进行严格把关。不同 ATMP的起始原材料种类不尽相同，一般包括质粒､工程菌､细胞基质､病毒载体等｡其中，工程菌､细胞基质、病毒载体等可能存在多种来源，常见的来源主要包括实验室来源､间接赠送国内外菌种/典型培养物保藏机构（如：ATCC和CCTCC）等。
除了起始原材料以外，还涉及其它一些生化原材料，包括培养基及添加组分､缓冲液､层析填料､消泡剂､消化酶､抗体等原材料，以及制剂处方中添加的缓存盐､稳定剂､冻存液､脂质体等辅料｡通常，不同来源的原材料或辅料的风险来源和程度也各不相同。
一般认为。以下几种培养环境或操作中引入外源因子的风险较高：
非GMP条件；
以病毒为载体进行基因改造等；
同一空间存在多种微生物或细胞；
使用含人源或动物源组分的物料或辅料等；
为了降低风险，必须选择来源明确且培养历史清晰的工程菌､细胞基质或病毒载体进行开发｡若为个人研究实验室中分离､改造所得，或使用培养历史不清晰的菌毒种或细胞基质，一般不建议用于商业化生产｡
为了保证质量的均一性，需要对起始原材料进行建库管理｡其中，质粒常采用工程菌库进行发酵和纯化生产，其外源因子的风险控制与核酸类基因治疗产品相似｡另外，部分体外基因修饰中所用的病毒载体的外源因子的风险控制与病毒载体类体内基因治疗产品相似｡工程菌库､细胞库和病毒种子的检定和管理应符合药典通则的要求｡
除细菌､真菌､支原体､分枝杆菌､噬菌体（工程菌）､内/外源病毒因子､逆转录病毒等常规检项外，还应重点关注以下一些特殊的外源因子:
种属特异性病毒：人源性病毒､鼠源性病毒等；
培养过程可能引入的病毒：血清相关的牛源病毒､胰酶相关的猪源病毒等；
历史溯源中可能引入的外源因子：历史培养中的微生物､细胞改造用的病毒载体相关病毒、病毒载体的历史包装细胞可能引入的病毒等等。
对于不同的产品，应制定不同的检控策略。对于CAR-T 等自体细胞治疗产品，由于起始细胞采集自患者本身，需制定适当的患者筛查标准｡对于干细胞、通用型免疫细胞等异体细胞治疗产品，可能需要进行多批细胞采集和建库，因此需要有更全面的供者筛查和细胞检测标准｡另外，对于干细胞等特定组织来源的细胞，除对供体进行常规健康检查和供血项目筛查外，还应检测组织细胞来源部位常见的病原体｡
针对不同的产品，亦应制定不同的检控策略。对于病毒种子，一般应在建立病毒种子批前采用多种技术手段和方法进行单克隆病毒筛选，以确保毒株的纯度｡非复制型病毒载体是细胞治疗产品基因修饰用的原材料，应关注野生型病毒污染的风险和控制｡另外，对于生产中使用的辅助病毒､滋养层细胞等原材料，其外源因子的风险考虑与病毒载体､细胞基质相似｡
生产环境和操作过程中，与工艺操作相适应的环境洁净等级、设备状态、生产操作、物料验收标准必须符合《药品生产质量管理规范》，且应避免在同一空间对不同样品同时进行操作处理。对于CAＲ-T 等部分自体细胞治疗产品，若同一生产区同时存在健康和具有病原体污染风险的细胞培养操作，故应对二者进行物理隔离，并分别采用独立的空气循环系统，避免外源因子交叉污染。
工艺步骤的设计应该以产品的特征和质量属性为基础，尽量减少开放式操作环节或单元，生产过程中避免不必要的补料或取样操作，从而最大程度地降低外源因子污染风险。如有补料或取样必要，应严格执行无菌操作。
对于质粒、病毒载体等可过滤除菌的产品，应在生产工艺中增加除菌过滤步骤。在病毒载体生产中，若使用了辅助病毒、包装用病毒、细胞基质等含有内源性病毒污染风险的物料，建议根据辅助病毒、包装用病毒或内源性病毒与目标病毒载体在理化性质方面的差异增加必要的病毒灭活或清除操作。
在生产过程中，一般需要在关键步骤或污染检出概率较大的步骤取样监测外源因子的污染情况。例如：在细胞培养终末阶段取样检测微生物负荷/细菌、内毒素、支原体、病毒等外源因子。对于病毒载体的包装生产，收获液中的目标病毒载体可能会对外源病毒因子的检测造成干扰，因此通常需制备相应的中和抗体以排除目标病毒载体对检测结果的影响。另外，可在相同的生产条件下培养对照细胞（不接毒），或在接毒前取样检测外源病毒因子，以排除细胞等起始原材料和培养过程中的污染风险。
此外，若存在中间产物的暂存操作，一般应对中间产物稳定性进行研究。除了研究中间产物的理化特性以外，还应同时考察细菌（或微生物负荷）、内毒素等安全性指标，以及保存容器的密闭性和保存条件的合理性。
病毒灭活/清除及验证策略
传统的生物制品生产工艺相对成熟，已有一系列与工艺相关的病毒灭活/验证的国内外指导原则。与传统生物制品的工艺不同，大多数ATMP的工艺中常缺少灭活、过滤等病毒清除步骤，仅病毒载体类基因治疗产品等ATMP的生产中包括病毒清除操作｡通常，可参考ICH Q5A 或《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》开展ATMP的病毒灭活/清除及验证研究。具体而言：
根据产品特点和验证目的选择相应的指示病毒（例如：以辅助病毒､包装用病毒､细胞内源性病毒等相关病毒或特异模型病毒为指示病毒）；
根据工艺步骤对病毒清除效果的潜在作用设计具体的验证单元和验证研究计划（例如：根据有包膜和无包膜的差异，考虑引入低pH值或有机溶剂/去污剂（S/D）法灭活病毒的步骤）；
根据电荷､病毒颗粒大小､病毒比重等理化特性差异选择分子筛､离子层析等步骤去除部分外源病毒；
根据验证研究的结果，结合上游收获液中潜在的外源病毒因子的载量、清除步骤的有效性以及外源病毒因子的残留风险进行设计｡
在通过上述原则设计和添加了病毒灭活/清除步骤之后，若能够将培养收获液中相应载量的辅助病毒､包装用病毒、内源性病毒等减少至相应的安全系数内，则证明病毒清除步骤的验证研究结果是有效的｡
一般而言，不同病毒之间的理化特性差异较小，这通常可能大大限制病毒清除/灭活步骤的设计和设置｡与传统的生物制品工艺不同，ATMP工艺中往往无法采用多步或不同原理的病毒清除/灭活步骤。然而，单一的病毒清除/灭活步骤的能力可能较为有限。因此，除了上述对原材料、辅料和工艺过程的控制策略以外，还需结合一系列的原液和制剂的质量控制策略来降低外源因子污染风险｡
原液和制剂的质量控制策略
ATMP的质量控制策略涉及原材料､生产过程､原液和制剂等多个阶段｡原材料和生产过程中的质量控制在前文已有相关介绍，此处仅介绍原液和制剂的质量标准中外源因子相关的风险控制策略｡
在ATMP生产中，常规检测项一般包括无菌和内毒素。此外，通常还需结合产品特点和具体的生产工艺设定ATMP的外源因子质量标准检控项目，具体而言：
若采用了大肠杆菌等工程细菌，应考虑噬菌体的污染；
若细胞治疗产品存在支原体污染的风险，应将支原体检测纳入质量控制系统;
若为可复制型病毒载体，应考虑野生型病毒载体的污染和控制；
若为非复制型或条件复制型病毒载体类产品，应考虑可复制型病毒载体的检测和控制；
若生产或包装中使用了包装病毒或辅助病毒，应考虑包装病毒或辅助病毒的残留和活性;
对于腺病毒、腺相关病毒等病毒载体的生产，应考虑易发生伴随污染的病毒载体的检测；
在细胞等产品培养中若使用了病毒载体进行基因修饰，应考虑病毒载体的残留，尤其是可复制型病毒载体的残留;
如有必要，还可考虑增加异常毒性检查｡
此外，应选择最具代表性且能最大概率检出外源因子的样品进行检测｡制剂配制工艺中若无相应的污染风险，可不用在制剂中重复检测原液中相应的潜在外源因子｡部分细胞治疗产品的有效期较短，其制剂的放行检测时效无法满足产品的放行需求，则可考虑选取生产过程中的中间产物进行检测，但检测结果应能代表终产品的外源因子污染风险｡
检测方法的专属性､精密度､灵敏度､检测限､耐用性等属性应满足产品的检测需求，IND 阶段应参考《分析方法确认指导原则》确认检测方法的适用性｡通常，无菌､支原体等药典方法检测时限较长，可能无法满足一些有效期较短的细胞治疗产品的放行检测需求。若采用开发的无菌或支原体快速放行检测方法替代药典方法用于产品放行检测，可参考《药品微生物检验替代方法验证指导原则》进行验证｡在充分验证方法的可替代性之前，建议在采用快速放行方法的同时同步留样以药典方法检测确认｡
容器密闭系统的控制策略
除上述因素以外，包装容器的适用性也会直接影响产品的质量和有效期。在选择包装容器时，不仅应满足相容性要求，还应考察容器的密闭性能。通常，可以采用微生物挑战或亚甲基蓝染料渗透等方法进行封闭性研究。除了常规的稳定性研究外，还需关注不同保存期限和特定保存条件下（高温、低温等）的密闭性能。
小编结语
随着生物医药技术的不断进步，ATMP产品的形式和功能越来越多样化，其生产工艺和质量控制技术也在不断更新迭代。在ATMP的生命周期中，外源因子的监测和控制极其重要。因此，研究开发者和监管机构需对产品的外源因子安全性进行全面评估，并开发和设计有效的控制策略｡
然而，不同类型ATMP的外源因子控制策略千差万别，ATMP的安全性研究和评价经验相对有限，且国内外对ATMP的技术要求也尚未形成统一标准。因此，相较于成熟稳定的传统生物制品，ATMP外源因子的安全性风险控制的难度更大。据此，需根据各类产品的特点和风险评估来设定控制策略和制定控制原则。
总体而言，应根据相关法规和指导原则对ATMP生产中的原材料、辅料、生产过程、原液、制剂进行全方位的外源因子安全性评价。首先，需科学分析和深入回溯近年来监测到的外源因子对ATMP带来的安全性风险。然后，根据这些结果制订相应的风险防控措施，对ATMP生产的全过程及产品的全生命周期进行有效管理，执行外源因子风险评估及质控，并进一步探索稳定性、敏感性和特异性较高的先进监测和控制策略，不断提高ATMP的安全和质量，为未来的治疗产品的开发和生产提供更多的可能性。
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