众所周知，肿瘤精准治疗的前提是精准诊断。如今，肿瘤精准诊断飞速发展，已进入分子病理时代。目前，多种方法可以用于肿瘤临床样本的检测，如ARMS，Super-ARMS，ddPCR和NGS(Next-generation sequencing，二代测序)等。NGS方法因其高灵敏性，多基因平行检测等优点，被广泛应用。而如何解读NGS报告经常是令医生和患者头疼的事情。一份NGS报告少则几十页，多则上百页。面对厚厚的“天书”，我们究竟应该如何把握要点，看懂一份报告呢？今天小编就来带大家整理一下肿瘤NGS报告解读的核心要点。
对于一份NGS报告，在样本数据从测序仪下机的那一刻，解读工作就已经开始了。将测得的基因碱基序列转变为可用于解读的突变列表，这背后经历了大量且复杂的生信流程。它的流程可以简单总结为：去除接头序列和低质量碱基、与参考基因组比对、识别并过滤突变、突变注释四步。每个步骤可选用的生信算法和软件都不止一种，而使用哪种算法和参数也会对最终结果产生影响，目前没有统一的标准。例如，突变的reads支持数大于多少时计为可信的阳性？一般，在用于实际样本检测前，检测机构会对每一个参数包括实验环节进行大量的性能验证，只有经过性能验证的参数才能保证准确、稳定的检出。（表1为解读时常用的公共数据库）
一份标准的肿瘤NGS基因检测报告分为四部分内容（图1），一是基本信息，包含患者姓名、样本类型、检测项目、检测日期等；二是基因检测结果，能够利用一页纸清晰明了的呈现本次检测的结果，便于阅读；三是临床释义，根据指南与共识，给予基因检测结果对应的临床治疗方案与用药指导，一些针对遗传基因咨询的检测报告，会列出一些风险和建议；四是附录，包含检测基因列表，质控信息，参考文献等。各检测机构的报告模板大同小异，但内容才是核心关键。
基于目前肿瘤临床诊疗用药的方向，NGS报告的用药解析一般会分为靶向用药和免疫用药两个章节，也是一份报告的核心所在，下面小编带大家分别来解读这两个章节。肿瘤靶向药物的种类较多，且作用于同一靶点的药物也很多，包括已上市或在研的，我们在实际报告中经常会碰到一个基因突变对应多个用药指导的情况，那么我们应该如何解读呢？2017年，美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理学家协会(CAP)联合发表了癌症突变解读指南与共识，将基因突变分为四个等级[1]。其中各级的定义是：A级：可用于FDA批准或专业指南中推荐药物治疗的突变；B级：用于预测药物反应或耐药性的大型临床试验证据或专家共识推荐的突变；C级：FDA批准用于其他肿瘤的治疗或多个小型临床试验中治疗的突变；D级：临床前研究或多个个案报道支持，可能具有临床意义的突变（图2）。很多检测公司也参考这篇指南，对突变解读进行类似的分级。明确了检出基因突变的分级后，我们再解读报告时，就会更加清晰明确。
[图2] ASCO和CAP联合发表的癌症突变解读指南中的证据分级
只完成突变的分级还不够，在正文部分，我们需要看到检测出的每个基因突变位点的意义和对应每种药物的入组人群、治疗结果等等的详细信息。在这部分，最能区别不同报告的解读水平。下面我们以一份真实报告为例，详细分析。图3是一份宫颈癌报告中对检出的PIK3CA基因的解读。首先，该基因检出的突变形式是：exon10 c.1633G>A p.E545K。意思是，PIK3CA基因的10号外显子上，第1633位的碱基由G突变为A，导致翻译的蛋白质的第545个氨基酸由谷氨酸（E）改变为赖氨酸（K）。该突变为激活突变，导致AKT磷酸化程度增加，从而可能导致细胞的增殖和转移[2]。因为目前尚没有针对宫颈癌获批或大型临床研究证实的靶向药物，所以与该突变相关的A,B级证据的药物没有。C级证据的药物有依维莫司、替西罗莫司、西罗莫司以及其它有前期临床研究药物等。在询证医学证据解析中，“两位宫颈鳞癌患者在经贝伐珠单抗联合替西罗莫司联合多柔比星治疗后，其中一位携带PIK3CA E545的患者出现疾病稳定，一位同时携带PIK3CA E545和549突变的患者出现PR”，我们看到，这份报告对每个临床试验都进行了说明，并且标出了具有相同位点基因突变的宫颈癌患者在服用药物后的疗效。试问，这样详细的且有参考价值的解读，有谁不喜欢呢？
据不完全统计，截至目前，在研的靶向药物有近百种，正在进行的临床试验超过2千个，每天都会有新的临床试验信息更新。可见，想要同步实时地更新解读内容，真不是一件容易的事情。
免疫治疗是近年来研究最热的治疗方式，与靶向治疗不同的是，免疫治疗是调动自身免疫细胞对肿瘤进行杀伤，一旦获益将出现“拖尾效应”，患者有很大机会高质量长期存活。在NGS检测报告中，肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）是免疫章节最重要的内容，它的定义是肿瘤基因组中平均每百万个碱基（1Mb）范围内所含非同义体细胞突变的数量。研究表明高TMB患者更容易从免疫治疗中获益[3]。但在实际算法中，TMB计算不仅是简单的数个数，Panel的大小，突变过滤的条件均会影响TMB的数值。目前行业内公认的 TMB 检测金标准是全外显子组测序（ WES ），但考虑成本较高很难应用于临床检测，而Panel测序可以与WES计算的TMB数值具有很高的一致性。但并不是所有panel都适合测TMB。推荐检测TMB panel 的 CDS 区域要≥1.0Mb，且 panel 包含有至少100 个以上相关基因。国内NGS大panel检测报告中基本都会有TMB的结果。但问题是，目前多数报告中只给出TMB计算后的数值，并未说明计算的规则和阈值，给医生造成了困惑。不同检测报告中TMB的解读如图4所示。
需要注意的是TMB作为免疫治疗的生物标志物也存在一定的局限性，TMB高的患者对免疫治疗的反应也不一致[4]，很多TMB低的患者对免疫治疗也有反应[5]。从最经典的checkmate-227的结果中，虽然我们看到高TMB（TMB≥10）相比低TMB（TMB＜10）的患者更能从Nivo + Ipi治疗中获益，具有统计学差异。但是从总生存（OS）数据来看，两组人群的HR分别为0.77和0.78，这也就是说TMB高的患者相较于低的患者并未降低死亡风险[3]。国内专家共识也都偏向TMB更可能是一个预后因子，而不是伴随诊断的biomarker。看来，TMB的解读还有一段路要走。除TMB外，还有其他在研究的免疫免疫疗效预测标志物，以及超进展相关的标志物。部分检测机构的NGS报告中前瞻性的将这些相关基因的检测结果单独进行解读并辅以文献说明，给免疫治疗提供了更多有价值的参考（图5），如JAK1/2、STK11、MDM2/4基因等[6-8]。
在肿瘤基因检测中，样本的全流程质控非常重要，一份报告如果质控结果不合格，就根本无法谈及结果的可信。那么在肿瘤NGS基因检测中有哪些关键的质控信息呢？图6是一份NGS检测报告实例，关键的质控信息分为三部分：病理环节质控、核酸质控、测序结果质控。病理质控是第一道质控，目的是确定我们检测的是肿瘤组织，而不是正常细胞。质量参数是肿瘤细胞含量，肿瘤细胞的含量会影响突变丰度，并最终影响阳性突变阈值的判定，一般要求肿瘤细胞的含量要大于10%。肿瘤细胞含量过低，会造成漏检和假阴性。核酸质控的关键参数是核酸的提取量和降解程度（提取质量），不同检测机构的核酸投入量不同，满足需求即可。若是由于样本包埋操作或存放不当造成了样本核酸的降解，则会影响最终的检测质量。测序环节的质控参数较多，我们只需特别关注测序深度即可。测序深度是指测序得到的碱基总量（bp）与目标区域的大小比值。注意区别测序深度和有效测序深度，因为只有有效测序深度下的数据才是用于突变分析的数据，有效测序深度过低容易造成假阴性或假阳性。在这份报告实例中，所有质控参数均在合格范围内，因此总体质量评估合格，检测结果可信。目前部分检测报告会显示每一步质控的详细结果，希望未来有更多的检测机构能够重视质控。
本文给医生和患者在解读NGS检测报告时提供了有价值的参考。在选择检测项目前，建议先看一下检测机构的报告实例，根据本篇介绍的要点，您也可以对检测报告的质量有一个评价。最后，感谢基因检测行业内的共同努力，相信国内肿瘤NGS基因检测报告的质量会越来越高，给医生和患者精准治疗提供强有力的依据。
参考文献：
[1] Li M M , Datto M , Duncavage E J , et al. Standards and Guidelines for the Interpretation and Reporting of Sequence Variants in Cancer[J]. The Journal of Molecular Diagnostics, 2017, 19(1):4-23.
[2] Dogruluk T , Tsang Y H , Espitia M , et al. Identification of Variant-Specific Functions of PIK3CA by Rapid Phenotyping of Rare Mutations[J]. Cancer Research, 2015, 75(24):900-902.
[3] Hellmann M D , Ciuleanu T E , Pluzanski A , et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Lung Cancer with a High Tumor Mutational Burden[J]. New England Journal of Medicine, 2018，378(22):2093-2104.
[4] Rooney M , Shukla S , Wu C , et al. Molecular and Genetic Properties of Tumors Associated with Local Immune Cytolytic Activity[J]. Cell, 2015, 160(1-2):48-61.
[5] Miao D , Margolis C A , Gao W , et al. Genomic correlates of response to immune checkpoint therapies in clear cell renal cell carcinoma[J]. Science, 2018, 359(6377), 801-806.
[6] Shin D S , Zaretsky J M , Escuin-Ordinas H , et al. Primary Resistance to PD-1 Blockade Mediated by JAK1/2 Mutations[J]. Cancer Discovery, 2017, 7(2):188-201.
[7] STK11/LKB1 Mutations and PD-1 Inhibitor Resistance in KRAS-Mutant Lung Adenocarcinoma[J]. Cancer Discovery, 2018, 8(7):822-835.
[8] ]Kato S, Goodman A, Walavalkar V, etal. Hyperprogressors after Immunotherapy: Analysis of Genomic AlterationsAssociated with Accelerated Growth Rate[J]. Clin Cancer Res, 2017, 23(15):4242-4250.
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