聚集诱导发光特性实现了“点亮”型的细胞成像和对细胞的原位杀伤
华南理工大学唐本忠院士团队秦安军教授等人基于课题组前期工作,在活细胞内开展了自发的炔-胺点击聚合反应，制备了分子量为7300的聚合物，并基于聚集诱导发光特性实现了“点亮”型的细胞成像和对细胞的原位杀伤。
细胞内化学反应作为生物学研究的有力工具已被用于生物成像、疾病诊断和治疗等领域。例如点击化学、Staudinger ligation等反应可以通过在细胞内生物大分子上引入反应性基团、荧光基团或药物分子等，在研究复杂的细胞内生理过程及疾病诊疗等领域发挥了重要的作用。然而，金属催化剂带来的细胞毒性、引入反应性基团带来的繁琐步骤及官能团反应活性过高导致稳定性差等问题限制了其应用范围。与此同时，聚合物相对于小分子体系具有更优异的光物理性能和协同放大效应，并可以解决小分子功能复合时的不足，因此在生物医药领域拥有着越来越宽广的舞台。但是，聚合物疏水的骨架结构导致其在生理环境中容易聚集从而不容易被生物体摄取和利用，且会面临聚集导致发光猝灭(ACQ)等问题。而利用聚集诱导发光(AIE)材料独特的光物理性能，发展一种在细胞内原位制备具有AIE性能的聚合物的方法，具有很大的研究价值及应用前景。
本工作中，基于该团队前期发展的自发的炔-胺点击聚合，结合细胞内丰富的氨基这一事实以及AIE特性的四苯基乙烯基团的引入可实现高的聚集态发光效率、良好的光稳定性和大的Stokes位移的特征，作者构筑了“lab-in-cell”。羰基活化的炔类单体可以自发地与含四苯基乙烯(TPE)的双胺在细胞内进行聚合并得到重均分子量(Mw)为7300的AIE聚合物(PAA)，并获得了“点亮”型的荧光成像。同时，通过破坏细胞内的微管蛋白导致细胞坏死，从而实现肿瘤细胞的杀伤。该策略为细胞环境中探索复杂的细胞内活动提供了一种有效手段。
图1 CLSM表征细胞内聚合。单体1（A）、单体2（B）先后与细胞培养20 min后，继续培养140 min（C）的成像图；单体1（D）、单体2（E）及实验制得的PAA（F）单独与细胞作用的成像结果。
作者进一步利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像表征了单体1和单体2的细胞内聚合。为了避免两种单体在培养基中相互反应，实验过程中两种单体先后与细胞孵育，之后用PBS洗三次。由于PAA具有AIE特性，可以通过监测荧光信号来研究聚合过程。如图1A所示，在与单体1孵育后，只可以在HeLa细胞中检测到微弱的绿色荧光，并且在加入单体2后荧光信号没有增强（图1B）。但随着孵育时间的延长，荧光信号越来越强，3小时后便可以观察到明亮的绿色荧光（图1C）。相比之下，仅用单体1处理的细胞几乎检测不到荧光信号，这可能是因为小分子容易被细胞膜上的蛋白质泵出。而仅用单体2孵育的细胞中也能观察到与1类似的现象。上述结果表明，自发的炔-胺点击聚合可以在细胞内进行，并且基于所含的AIE基元可实现“点亮”型荧光成像。作为对照，作者将实验制备获得的PAA与HeLa细胞孵育，成像结果显示其并不能穿过细胞膜，细胞内没有荧光信号，进一步表明细胞的荧光信号来源于单体1和2在细胞内自发点击聚合所得的PAA（图1F）。
此外，作者将细胞裂解并进行相关处理后，用THF溶解沉淀物，并用凝胶渗透色谱测定分子量。结果显示只有与两种单体先后孵育的细胞组可以检测到分子量为7300的产物，而其他对照组基本检测不到大的分子量产物。作者还利用红外光谱表征了细胞内聚合产物，发现产物中单体2的≡C-H（3225 cm-1）和C≡C（2078 cm-1）的伸缩振动峰消失，并伴随着C=C（1603 cm-1）伸缩振动峰的生成。该红外光谱表征结果与在溶液中制备得到的PAA结果基本一致。以上实验结果表明确实通过原位的细胞内炔-胺点击聚合制备了具有AIE性能的聚合物。
图2 单体1（A）、单体2（B）及细胞内聚合（C）的细胞毒性；空白组（D）及细胞内聚合（E）的细胞分别用凋亡探针SR-DEVD-FMK及PI共染后的成像图；(F)空白组及细胞内聚合的HeLa细胞SEM表征图。
作者进一步通过MTT测定评估了细胞内聚合产物的细胞毒性。鉴于培养基中存在的大量氨基酸，作者将单体分散在PBS中，并与HeLa细胞分别作用20分钟，然后用新鲜培养基替换并孵育24小时。如图2所示，单体1具有良好的生物相容性；而单体2在高浓度下展现出轻微的细胞毒性，这可归因于通过其与蛋白质氨基反应封闭了细胞的一些功能。而当细胞先后与单体1和2作用后，再继续在培养基中培养24 h，细胞毒性明显增加。通过凋亡试剂及扫描电镜表征发现，该细胞内聚合反应诱导细胞死亡不是通过凋亡途径，而是诱导细胞坏死达到细胞杀伤的效果。
综上所述，作者在细胞内实现了自发的炔-胺点击聚合，不仅可以实现细胞的“点亮”型荧光成像，而且还可用于肿瘤细胞的杀伤。这种新型的“lab-in-cell”扩展了点击聚合在生物领域中的应用，为研究细胞内的生理过程提供了强大的工具。
该成果以“Lab-in-cell based on spontaneous amino-yne click polymerization”为题，最新在线发表于Science China Chemistry, 并于2018年11月12日申请了中国发明专利保护。论文第一作者为华南理工大学胡蓉博士，通讯作者为秦安军教授和唐本忠院士。
详见：Hu Rong, Chen Xu, Zhou Taotao, Si Han, He Benzhao, Kwok Ryan Tsz Kin, Qin Anjun, Tang Ben Zhong. Lab-in-cell based on spontaneous amino-yne click polymerization. Sci. China Chem., 2019, DOI:10.1007/s11426-019-9517-9.
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