王立铭: 基因编辑技术背后的潜在纷争
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最近两年，基因编辑技术CRISPR/Cas9迅速崛起，备受瞩目。2016年1月4日，张锋参与创办的Editas Medicine公司正式提交上市申请。然而技术跑得太快，产业化资本也争相介入，以致于其他潜在隐患被落在了后面。专利问题，伦理问题。。。很多事情都还需要论证和检验。请看王立铭教授围绕相关焦点人物的独家深度分析。
知社学术圈原创整理；特别致谢王立铭教授授权
埃马纽埃尔·卡彭蒂耶 (Emmanuelle Charpentier)，1968年出生，法国微生物学家，生物化学家。卡彭蒂耶1995年在巴斯德研究院获得博士学位，后活跃于美国各大高校和医院。返回欧洲后任瑞典于默奥大学分子传染医药实验室研究带头人。2013年出任德国不伦瑞克传染研究赫姆霍兹中心教授及汉诺威医学院教授。2015年成为马克斯普朗克学会会员，并担任新马克斯普朗克传染生物学研究所负责人。
詹妮弗·杜德纳 (Jennifer Anne Doudna)，1963年出生，加州大学伯克利分校的化学和分子生物学与细胞生物学教授。杜德纳在哈佛大学取得生物化学博士学位，后于科罗拉多大学波德分校从事博士后研究。自1997年以来，她是霍华德·休斯医学研究所 (HHMI) 的研究者。2012年，其研究团队发现可减少DNA编辑工作量的新方法，该技术通过引导细菌免疫系统CRISPR中的蛋白质Cas9，对DNA进行定点切割。2015年，杜德纳与卡彭蒂耶共同获得全球最具影响力人物100强提名，并获得阿斯图里亚斯亲王奖。
张锋 (Feng Zhang)，1983出生，美国籍神经生物学家，现任麻省理工学院生物医学工程教授。2004年，在哈佛大学取得化学及物理学士。2009年，在斯坦福大学取得化学及生物工程博士。2013年，他的实验室发展出CRISPR/Cas系统，可以用来编辑DNA，敲除指定的基因。2014年，被《自然》杂志评选为2013年年度十大科学人物之一。2015年，获名古屋大学颁发首届“冈崎恒子＆令治奖”。
到底什么是CRISPR，这么拗口的一个名字？相信很多人会有这样的疑问。它的全称叫做叫 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，翻译成中文就是“成簇规律间隔短回文重复序列”，是不是听了更加一头雾水？请听我们解释：
CRISPR本身其实就是基因组DNA上的一段特殊的序列，这段序列倒是很有个性：几十个碱基构成的特殊DNA序列连续串联重复多次，在重复单元之间的间隔也差不多有几十个碱基那么长，但是这些间隔序列的构成却是千变万化毫无规律可循。当上个世纪八十年代末，日本科学家在几种细菌的基因组上发现这么一长串很有个性的序列时也着实被迷惑了，只好老老实实 41 36818 41 15263 0 0 3104 0 0:00:11 0:00:04 0:00:07 3104在论文里描述了一下它的样子就束之高阁了。这一迷惑，居然就迷惑了差不多二十年。在此期间世界各地的科学家陆续在不同的细菌中发现了类似的CRISPR序列，但是始终不清楚这种序列到底意味着什么。
在2000年就有几位西班牙科学家查看了下当时已经具有完整基因组信息的许多种细菌，居然看到二十来种细菌和古细菌里，都带有结构组成相当类似的CRISPR序列！这其中还有相当部分的序列，恰好还和许多当时已知的噬菌体基因组序列信息高度一致。这就有意思了，要知道对于任何有机生命来说，小心翼翼的保存、复制和传递遗传物质信息都是件很困难、也很浪费资源的事情。在自然选择的作用下，很难想象会有这么多不同的物种会不约而同的保留这么长长一串一点功能也没有的DNA序列。因此，一个直觉的猜测就是，CRISPR序列应该是有生物学功能的，而且很可能是对细菌来说至关重要的功能。
在2007年，一群在杜邦公司旗下的丹尼斯克食品配料公司工作的科学家，在嗜热链球菌中，严格证明了CRISPR序列对于细菌免疫系统的功能。他们证明，在这种细菌中人工添加一段CRISPR序列，就可以像给细菌打了疫苗一样，可以帮助细菌抵挡某种对应病毒的入侵！这群科学家同时也证明，细菌的免疫系统还有自我进化的高级功能，每当有新的噬菌体病毒入侵，细菌就可以把它的基因组序列整合到自己的CRISPR序列中，这样下次同样的病毒入侵细菌就可以正确识别和对抗它们了。
发现细菌CRISPR序列和噬菌体基因组序列高度一致之后，科学家们在第一时间就很敏锐的意识到，也许CRISPR序列的目的正是定位入侵的病毒。
这个可能性迅速得到了验证。科学家们发现，细菌的CRISPR序列在正常情况下是可以被转录成RNA分子、游离于细胞当中的。这些小段CRISPR RNA分子能够充当向导的角色，带着一个名为Cas9的核酸酶蛋白，在细胞体内终日游荡。而当某时某地某个情况，病毒入侵、病毒DNA充斥细胞时，带着向导的Cas9就有用武之地了。一旦它发现某个病毒DNA的序列，和自身向导的序列完全一致，Cas9就可以大发神威，把病毒DNA咔嚓一刀断了根。一刀两断的病毒当然就失去了鼠窃狗偷、继续利用细菌的资源生存繁衍的能力了。我们一句话总结就是，细菌的免疫系统其实就两个几段简化的组件，CRISPR RNA用来精确定位病毒的入侵；而Cas9蛋白则专门剪断已经被识别的病毒。
2005年，美国加州大学伯克利分校的结构生物学家珍妮弗·道德纳 (Jennifer Doudna) 偶然从地球微生物学系的同事吉莉安.班服尓德 (Jillian Banfield) 那里听说了CRISPR 。她的实验室从附近的铁矿中发现的许多细菌，也带有这种神奇的CRISPR序列。
道德纳是早已功成名就的结构生物学家，长期利用X射线衍射的方法了解蛋白质大分子的三维结构。她尤其对和RNA分子相关的蛋白质结构感兴趣。因此当几年后道德纳意识到CRISPR RNA能够指导Cas9蛋白发现病毒入侵者时，她意识到现在轮到自己上战场了，她希望利用自己的看家本领，在单个原子的尺度上，看清楚CRISPR RNA究竟如何帮助Cas9蛋白实现病毒基因组的精确定位。我们现在知道，Cas9蛋白是如何在CRISPR的指引下精确定位基因组，随后剪切破坏目标DNA的。道德纳和同事们的工作，从原子水平完美的解释了细菌免疫系统、特别是CRISPR这个超轻量级基因组GPS的工作原理。
2011年，道德纳飞往美丽的加勒比海小岛波多黎各参加一场由美国微生物学会组织的会议。会议的主题是细菌中的RNA分子，这正是道德纳整个职业生涯一直关注的目标。一位表情严肃的女科学家走上前来，轻声问道：“能出去走走，顺便请教您几个问题么？”
这个女科学家是任教于瑞典于默奥大学的法国人艾曼纽.卡朋特 (Emmanuelle Charpentier)。这场不期而遇的对话标志着人类基因治疗领域新的起点，毫无异议的将被写入当代科学史。
在这场对话中，卡朋特提到她自己的实验室在研究一种危险的人类致病菌——化脓链球菌 (Streptococcus pyogenes) ——当中的CRISPR序列。她的实验室发现在这种细菌中，一种名叫Cas9 (当时的名字是csn1) 的蛋白，似乎独立就可以完成利用CRISPR序列定位和切割病毒基因组的能力。这一点出乎道德纳 (也包括领域中大多数科学家) 当时的预料。因为按照当时的理解，人们一般认为识别和切割病毒基因组需要一大堆蛋白质的参与。
于是两个相隔万里之遥的实验室迅速的联起手来，他们的合作，最终在2014年完美解释了CRISPR/Cas9系统的工作原理：Cas9蛋白就像一个有着两块卡槽的接线板，能够同时插进一条CRISPR RNA，和一条病毒基因组DNA，而当CRISPR RNA和病毒DNA的序列一一对应时，Cas9蛋白会发生变形，准确的卡住病毒DNA并毫不犹豫的挥起剪刀。这正是细菌免疫系统的工作原理。
2012年夏天，两个实验室联手证明，的确如卡朋特所猜想，体外纯化的cas9蛋白单独就可以发挥定位和切割基因组DNA的功能。更重要的是，她们发现，Cas9蛋白定位的功能完全依赖于CRISPR RNA那么几十个碱基的序列信息，如果人工编辑CRISPR RNA，就可以让Cas9蛋白指哪打哪，切割任意指定的DNA。这个结果清晰地指向了一种全新的基因组编辑技术：理论上人们只需要设计一段几十个碱基的CRISPR，然后加上天然存在的Cas9蛋白，就可以随心所欲的定位和修改任何一段人类基因组了！
在2013年初短短数周时间内，三个研究组相继证明，人工设计的CRISPR序列与Cas9蛋白结合，在人类细胞中同样可以高效的定位、剪切和修改基因组。这项人类基因组编辑的新技术正式走入现实。这三个研究组包括道德纳自己，也包括在”神话“蛋白技术的开发者、任教于哈佛大学医学院的乔治·钱奇 (George Church) 和任教于麻省理工学院布罗德研究所的张峰。
和以往的基因组编辑技术、例如锌手指蛋白技术和”神话“蛋白技术相比，CRISPR的优势实在是太过明显。一方面，从工具准备的角度看，设计和生产一个用于定位的CRISPR，对于任何一个稍经训练的生物学研究人员来说都是易如反掌的事情，远远简便于锌手指蛋白和”神话“蛋白的组装；另一方面，上述三个实验室的工作也证明，CRISPR系统工作的效率要远远高于其他两种技术，这意味着现实中改变任何生物乃至人类自身的基因组的成功率要高的多。甚至在上述张峰实验室的论文中，他们还证明可以一次性利用几个CRISPR来实现对基因组的多点精确打击，这是之前任何基因组编辑技术都无法达到的高效率。而在各种各样的工业应用中，高效率就意味着低成本，意味着短周期，意味着把许多不可能变为可能。
因此几乎在第一时间，资本疯狂涌入了这个看起来遍地黄金的市场。是啊，在如此高效的技术背景下，有太多太多愿景可以去自由畅想。我们是不是可以利用这项技术，修改各种农作物和农业牲畜的基因组，让它们更加高产、抗害、有营养？我们是不是可以改造各种工业微生物，让酸奶更可口，奶酪更香醇，葡萄酒更醉人？
而我们。。是不是也可以用它来修改受精卵的基因组、以避免先天遗传病；修改患者的基因组，治疗他们的病患；甚至让我们人类更聪明，更健康，更长寿？
有市场分析认为，几年之内以CRISPR为基础的基因组编辑市场会达到每年数十亿美元的市场规模。而更乐观的估计则认为，这是一个年销售额接近五百亿美元的庞大市场。要知道，当市场分析家做出这些预测时，CRISPR技术刚刚有了还远不算成熟的原型，连实验室应用都谈不上！
于是在全世界的实验室你追我赶的继续完善和发展CRISPR技术的同时，围绕着知识产权的战争开始了。这并不奇怪，我们在前面的故事里已经讲过专利的重要性。面对CRISPR/Cas9这项具有巨大潜在经济利益的技术，谁拥有了它的知识产权，谁就有可能最大化市场收益。
2014年4月15日，美国专利与商标局 (USPTO/USPatent and Trademark Office) 在万众注目中，将与CRISPR/Cas9技术相关的第一个专利，授予张峰所在的布罗德研究所，而张峰是专利的第一发明人。这项内涵及其深广的专利涵盖了CRISPR/Cas9技术在所有真核生物——包括各种动物、农作物和人类自身——中的应用。
这项专利意味着，从此以后，任何公司如果试图利用CRISPR/Cas9技术改造动物、植物、微生物乃至人类自己，必须首先从布罗德研究所获得专利授权，否则就侵犯了布罗德研究所的专利权。布罗德研究所靠这项专利不光可以坐拥主动送上门来的滚滚专利许可费，而且可以从源头控制整个基因编辑和基因治疗产业！
这边布罗德研究所的庆功酒还没开场，那边的枪炮番茄已经一齐丢了过来。围绕CRISPR/Cas9技术的所有权问题，一场战争一触即发。
有备而来的布罗德研究所一口气提交了上千页的原始证据，从基金申请书、个人通信记录一直到实验记录本，试图证明张峰实验室早在2012年初、道德纳/卡朋特的论文发表前已经独立发明了这项技术。与此同时，布罗德研究所的另一项有力指控是，尽管道德纳/卡朋特的论文说明CRISPR/Cas9技术的可行性，但是张峰实验室却是首先证明这项技术能够应用于改造细胞内基因组的，因此如果想要在动物植物甚至人类的细胞中编辑基因组，理所应当从布罗德研究所获得授权。
深感被忽悠和羞辱了的加州大学和道德纳/卡朋特一方显然不会那么容易放弃这只下金蛋的鹅。在一年的精心准备之后，加州大学于2015年4月向美国专利与商标局提交了多达114页的抗辩材料，以及几千页的补充证据。他们试图让美国专利局相信，布罗德研究所的专利无效，而加州大学才是这项技术真正的拥有者！加州大学提交的证据似乎也滴水不漏，一方面，他们试图说明，张峰实验室所提交的参考材料——包括实验记录本——仅仅能说明对方进行了相关的尝试，并未说明这些尝试真的成功了。其次，针对布罗德研究所所谓”率先在细胞内应用CRISPR/Cas9技术“的声明，加州大学的立场是，从道德纳/卡朋特的论文中猜测和联想到这项技术能够用于细胞内是显而易见、顺水推舟的事情，根本不足以支持一项发明专利的创新性。
针尖对麦芒，三个CRISPR领域世界顶尖的实验室，两家在生物医学领域引领时代的研究机构，就这么宣战了。事实上，加州大学的抗辩宣告了关于CRISPR所有权的争议几乎已经不存在任何和解的可能，如果专利局判定加州大学的抗辩有效，那么布罗德研究所就将失去围绕CRISPR的一切知识产权；反过来如果专利局裁定加州大学抗辩无效，那么道德纳他们只能两手空空的看着布罗德研究所从此独占基因组编辑和基因治疗这个巨大市场。
于是整个世界，都开始屏息等待美国专利局的裁决。上一次一纸薄薄的专利授权书吸引全世界的目光，可能要追溯到近一百年前，天才的勤杂工、发明家费罗·法恩斯沃斯 (Philo Farnsworth) 赢得了与巨无霸美国广播公司 (Radio Corporation of America, RCA) 的专利权官司，捍卫了自己电视发明人的地位！
专利所有权之争，似乎并没有阻挡资本的脚步。
尽管现在谁都难以预测CRISPR技术的专利终将花落谁家，又或者是否能以一种共赢的方式达成和解，投资人和医疗行业巨头们对这项技术的兴趣还是在不断高涨着。
我们在这个基因治疗系列故事里面反复讲到过不同遗传疾病的例子，也讲到过不同历史时期，人们利用不同的基因组改造技术试图征服遗传疾病的尝试，有辉煌的成功，也有惨痛的失败。
但是大体而言，基因治疗领域始终在紧跟着基础研究的步伐。在上世纪九十年代，人们已经开始利用病毒载体，把DNA以一种”缺啥补啥“的逻辑补充到基因缺陷疾病患者的体内。等到更精细的基因组编辑技术——包括锌手指蛋白和”神话“蛋白——出现，人们开始看到希望，这些对基因组进行精确定位和编辑的技术，也许能够极大地完善基因疗法的技术手段。毕竟，传统基因疗法仅仅是把出现缺陷的DNA重新放回患者体内，至于放回的效率、数量和地点都难以控制。如果说新兴的基因组编辑技术像是高精度的巡航导弹，传统的基因疗法可能最多算是大炮炮弹，有杀伤力，但是太粗放、太低效、太有破坏性。
CRISPR/Cas9技术的登场，把基因治疗的武器库升级到一种前所未有的高度：它的设计和制造极其简单，技术门槛很低 (只需要设计一段几十个碱基构成的CRISPR序列)；它的打击效率非常高，甚至可以实现一次发射、多重打击 (可以一次基因治疗使用多个CRISPR片段，同时修改几个疾病位点)；它的打击方式更加多样化 (人们已经证明，使用CRISPR、Cas9技术，可以对特定基因组位点实现删除、修复、替换等等功能)。
因此尽管专利权之争尚未尘埃落定，针对CRISPR技术的研究和临床应用已经蓬蓬勃勃的开展起来。
知社学术圈原创整理。特别致谢王立铭教授授权。
喝茶聊天心有灵犀，钻研切磋触类旁通
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