荧光原来是这么衰减没滴！

上期内容（了解荧光（光谱）从这里开始）我们介绍了荧光光谱的基本概念和稳态光谱的解读。本期内容将介绍时间分辨荧光光谱和荧光寿命。

1. 什么是时间分辨荧光光谱？

上期内容中提及的激发光谱和荧光光谱都是稳态光谱，其记录的是荧光强度（I）与波长（Wavelength）的关系，如图1左。准确的说，这里的荧光强度都是平均强度。在时间分辨荧光光谱中，纵坐标为荧光强度（I（t）），横坐标为时间（t）。其记录的是荧光强度随时间的变化。一般在测试中，利用一定波长的激光脉冲信号激发样品，然后观测样品所发出荧光信号的衰减情况，所得曲线称为荧光衰减曲线，如图1右所示。

图 1

2. 为什么需要时间分辨荧光光谱？

产生荧光的本质为激发电子与空穴的辐射性复合，而这种复合可以有多种类型。比如可以单通道、双通道、多通道等等。比如在大分子中，不同的构型往往对应着不同的衰减通道，荧光寿命也不尽相同。在量子点纳米晶中，衰减通道常常和表面缺陷、能量转移、多激子发射有关。这些信息在稳态光谱中都无法体现，但时间分辨荧光光谱则能够给出相关信息（后期将会有实例分析）。

3. 荧光究竟是如何衰减的？

用很短脉冲光激发荧光体，荧光体被激发到激发态。处于激发态的荧光体将辐射跃迁并发出荧光。如果发出荧光的过程为一级反应，将有下式：

上式中 n（t）为激发后 t 时刻处于激发态荧光分子的数目，T、Knr为辐射跃迁和非辐射跃迁速率，如图2所示。

图 2

积分上式，并且通常荧光强度  I 和 n（t）成正比，所以荧光强度随时间的变化关系式：

式中τ =1 /（T + Knr），即荧光寿命。以ln（I）对 t 作图就可以得到图1b所示荧光衰减曲线，通过斜率可以算出荧光寿命 。荧光寿命的定义为当激发光切断后荧光强度衰减至原强度1/e所经历的时间。但这并不是意味所有的荧光分子衰减的时间为τ。因为荧光发射是一个随机过程，只有很少的荧光分子在时间为τ时发射。如果荧光为单指数衰减，那意味着t = τ之前63 %的激发态分子已经衰减了，而37 %的激发态分子在t > τ衰减。

4. 时间分辨荧光光谱仪

荧光寿命的测定方法主要有三种:时间相关单光子计数法（Time Correlated Single Photon Counting, TCSPC）、相调制法（Phase Modulation Methods）和频闪技术(Strobe Techniques)。TCSPC是以统计学为基础，也是目前最成熟、最准确的荧光寿命测定方法。TCSPC的工作原理图如图3所示：

图 3

光源发出的脉冲经分光镜分成两束，一束作为start信号触发TCSPC，电子板卡开始计时。一束先经过样品,发出的荧光信号经过单色仪、光电倍增管后,到达TCSPC板卡，作为stop信号，以终止计时。几十万坎重复测量之后，不同时间通道累积下来的光子数不同，以光子数对时间作图，即可得到荧光衰减曲线。检测原理的关键在于激发光源信号到选检测器与荧光信号到达检测器的时间差。在实际测量中，必须调节样品的荧光强度，以防止一次激发产生多个荧光光子达到光电倍增管而造成寿命测量值偏短。一般情况下，脉冲光源激发样品后，样品发出的荧光光子要衰减到1/20后才能进入光电倍增管（本节内容来自博士论文《核壳量子点激子态的合成控制》）。

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