瑞典查尔姆斯理工大学Nat Chem Biol|从头合成磷脂衍生物-工程化改造重塑酵母磷脂代谢

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遇见/摘要

油酰乙醇酰胺(oleoylethanolamide: OEA, C18:1 N-acylethanolamine)是一种磷脂衍生物，在减轻脂质功能障碍和神经行为症状方面具有广阔的应用前景。目前尚未开发磷脂衍生化合物的生物合成途径，部分原因是宿主中与生长相关的复杂的磷脂代谢。为了应对这一挑战，本文开发了酿酒酵母平台，用于从头合成OEA。通过解除磷脂代谢调节，生物合成酶的筛选，亚细胞运输工程和工艺优化，可以产生8,115.7 µg l−1的OEA，与原始产OEA 菌株相比，提高了 90 倍。尽管滴度很低，但本研究代表了 OEA生产的实质性进步，并证明了工程化磷脂代谢过量合成基础物质以生产增值化学品的的可行性。

Fig. 1 Engineering a phospholipid platform forde novo biosynthesis of NAEs in yeast. OEA与其他NAE 共享大部分生物合成路线，仅在酰基链选择上有所区别。NAEs的生物合成比较保守，来源于相应N-酰基磷脂酰乙醇胺（NAPE）的水解

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参考文献：Engineering yeast phospholipid metabolism for de novo oleoylethanolamide production ：https://www.nature.com/articles/s41589-019-0431-2.pdf

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遇见/内容

OEA 是一种N-酰基乙醇胺（NAE)，N-酰基乙醇胺（NAEs）是一组天然的脂质，在结构上由与乙醇胺上氮原子相连的脂肪酰基变体组成。作为一种安全的生物活性脂质，OEA受到食品和制药行业的广泛关注。尽管使用当前的合成技术已经取得了很大的进步，但是OEA的制造仍然受到极大限制。鉴于磷脂代谢涉及多个细胞器的结构多样且受严格监管的系统以及操纵非常复杂，目前并没有研究通过改造微生物菌株中的磷脂代谢来过量生产NAEs。而本文为了应对这一挑战，开发了酿酒酵母平台，用于从头合成OEA。

Fig. 1 Engineering a phospholipid platform forde novo biosynthesis of NAEs in yeast. OEA与其他NAE 共享大部分生物合成路线，仅在酰基链选择上有所区别。NAEs的生物合成比较保守，来源于相应N-酰基磷脂酰乙醇胺（NAPE）的水解

为了实现OEA的从头生物合成，本文研究了NAT 和NAS两种磷脂衍生的合成途径。磷脂 PE 是共有的前体，同时将第二种底物 PC 或酰基辅酶A 分别掺入NAT 或NAS 分流途径中，以形成关键的中间体 NAPE。为了确保有足够的磷脂前体供应用于生产OEA，选择了具有增强酰基辅酶 A 供给的菌株YJZ45 作为起始菌株，并逐步纠正了 YJZ45 不良遗传修饰，最终得到的菌株PL03总磷脂含量相对于菌株 YJZ45提高了近 650％。

酵母磷脂平台的建立后，开始选择用于OEA生物合成的酶。特定的OEA生物合成途径包括两个主要过程：合成磷脂衍生的 N-油酰基磷醇胺（NOPE）；将 NOPE转化为OEA（Fig. 2a）。NOPE的形成需要NAS 或是NAT分流途径，而多种途径可以进行OEA合成，其中磷脂酶D（PLD）是最直接的途径。为了选定通过两个分流途径合成OEA的基因组合，作者对NAT和NAS编码基因合成NOPE的能力进行了测定，显示所得菌株 YLP03 具有最佳的OEA产量（Fig.2b）。随后，基于 RLP1评估了选择筛选的5个PLD编码基因的NOPE水解能力，HsNAPE-PLD的性能优于其它PLD编码基因，使得OEA效价进一步提高（Fig. 2c）。之后整合了不同拷贝的表达最佳的基因组合 HsNAPE-PLD和RLP1来合成OEA，具有三个基因组合拷贝的菌株 YLGC-3 产生的滴度与菌株 YLGC-2 和表达质粒 YLP03 的滴度相当，表明磷脂前体的供应可能不足，限制了OEA的生物合成。因此，后续以 YLGC-3 菌株为新平台，进一步改善磷脂的生物合成以生产OEA。

Fig.2 Enzyme screening towards improving biosynthesis of OEA. a, Schematicillustration of OEA biosynthetic pathway. b, OEA production of PL03 strain overexpressing different NOPE biosynthetic genes.c, OEA production of PL03 strain overexpressing different PLD-encoding genes.

为了进一步提高OEA的产量，本文通过增强前体物供应，减少竞争途径，动态控制基因表达和平衡前体物比率这些系统工程技术来解决代谢瓶颈。具体为单独或组合过表达编码四种酶主要同工型的基因，消除潜在的磷脂生物合成负调控，减轻内质网和线粒体之间的底物转移边界来促进PE生物合成，整体补充酰基辅酶 A和特定补充油酰基辅酶A，减少潜在OEA降解途径。

之后通过高拷贝质粒系统提高OEA合成基因的转录水平，并比较组成型启动子和动态半乳糖激活的GAL启动子的效率。相应地，半乳糖诱导的转录模式的实施导致菌株 YL-O3 的 OEA效价比菌株YL-O2 提高了 42％（Fig.3b）。而且菌株 YL-O3 的细胞生长基本恢复，表明使用诱导型启动子可以减轻细胞生长与 OEA 生物合成之间对磷脂的竞争。将OEA生物合成途径锚定到 ER促进底物转移，（Fig. 3b），调节底物稳态（Fig. 3c），优化培养条件（Fig. 3d），菌株二倍体化（Fig. 3e）都使OEA产量得以提升。

Fig.3 Combinatorial optimization to increase theproduction of OEA. a, Schematic representation of the biosynthetic pathway forphospholipid-derived OEA production. b, Dynamic control and compartmentalizationstrategies were applied for OEA production. c, The expression of PEmethyltransferase-encoding gene CHO2 was fine-tuned via promoter substitutionto balance the two precursors PE and PC. d, Process optimization for OEAproduction. e, OEA production of strain YL-NA30 and corresponding diploid strainYL-NA30D in optimized cultivation conditions.

本研究不仅证明了酵母磷脂代谢可以定向合成某些化学物质，而且确保了有效地生物合成化合物而不损害细胞生长。总之，本文设计了一种用于OEA生产的酵母细胞工厂，表明酿酒酵母可以用于生产磷脂衍生的化合物，并为工程酵母提供了一个多方面的框架，以应对新的化学品生物合成途径的严格调控和代谢瓶颈。

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遇见生物合成编辑部

2019年

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