NC 体内光控重组酶|合成生物学和神经科学利器

时空控制基因表达或标记是识别复杂神经回路中基因功能的有价值的策略。近期在 Nature Communications 上，Wen Do Heo 课题组开发了一种高度光敏和高效的光活化Flp重组酶( PA-Flp )，适用于体内基因操作。PA-Flp的高度光敏特性非常适合于通过无创发光二极管照明来激活小鼠大脑深部区域。此外，PA-Flp可以通过病毒载体作为Flp依赖性Cre表达平台延伸至Cre-lox系统，从而激活Flp和Cre。最后，科研人员证明了PA-Flp依赖性、Cre介导的内侧隔膜中的Cav3.1沉默增加了小鼠的物体探索行为。因此，PA-Flp是非侵入性的、高效的、易于使用的光遗传模块，为神经科学研究提供了无副作用和可扩展的基因操作工具。

复杂大脑功能的研究需要高度复杂和强大的技术，能够在活体动物身上进行特异性标记和快速基因改造。为了操纵完整的回路或功能，已经开发了许多利用光、小分子、激素和肽以时空方式控制基因或蛋白质活性的方法。使用化学诱导系统如Cre-ERT2、DD-Cre和诱导型启动子引导的Cre的Cre/loxP重组是体内基因修饰系统中最常用的。其他方法包括绿色荧光蛋白( GFP )表达细胞( Cre-DOG)或双启动子驱动的交叉细胞群的子集内的选择性或条件Cre激活系统。然而，这些方法受到建立敲入小鼠系所需的大量时间和努力的限制，并且受到时空控制的限制，时空控制依赖于一组有限的可用基因启动子和转基因小鼠资源。

除了这些限制，光遗传学方法能够以高时空分辨率控制小鼠大脑中遗传定义的神经元的活动。最近，使用分裂-Cre开发了两种光活化-Cre重组酶( PA-Cre )的光遗传模块，其中一种组分与CRY2和CIB1融合，另一种组分与正磁体( pMag )和负磁体( nMag)融合。在这两种情况下，用蓝光照射都会引起异二聚化。然而，迄今为止，一个能够揭示小鼠大脑中特定目标基因时空功能的基因操纵光遗传模块仍然遥不可及。

Cre/loxP重组已被确立为哺乳动物的一种高效基因操作系统，并构成了目前小鼠资源中存在的条件基因敲除/的主要技术。Flp/Frt系统在体内，包括脑组织中的复杂基因操作中的应用，自从Flp重组酶最近的改进产生了耐热密码子优化的版本( Flpo )，在哺乳动物中有效发挥作用以来，已经速度飞快发展。Cre和Flp在Cre/Flp系中的组合使用，其中表达由组织或细胞类型特异性启动子驱动，这使得通过活体中的条件性或选择性遗传诱变，能够对不同的细胞群体进行更详细的研究。然而，迄今为止，还没有开发出这样的光诱导Flp系统。因此，科研人员开发一种光活化Flp重组酶( PA-Flp )，充分利用光刺激提供的高时空控制。

科研人员证明了PA-Flp作为一种用于小鼠大脑的无创体内光遗传操作工具的效用，甚至适用于通过外部LED照明到达海马体或中间隔( MS )的深层大脑结构.此外，我们设计了一个Flp依赖的Cre驱动程序，作为一个模块，在病毒载体系统中没有泄漏的Cre表达，最终在MS神经元中显示了无创的光依赖的Cre介导的Cav3.1基因沉默，实现客观探索行为的增加。