cell杂志：融合环状RNA文献解读
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尽管原癌蛋白在肿瘤发展中起到关键作用是无容置疑的，但原癌蛋白并不是唯一导致癌症的因素。从非编码RNA的维度如microRNA，假基因，lncRNA和最近发现的环状RNA，为肿瘤研究开启了新大门。但肿瘤基因组的染色质易位是否影响circRNAs还完全不清楚。前期的研究表明circRNA形成环化并不是可变剪接产生的被动结果，还是有环化外显子侧翼序列特异重复序列或RNA结合蛋白结合位点主动介导的，预示circRNA存在重要功能。许多类型的肿瘤细胞基因组存在染色体易位和重排现象，染色体这种易位和重排现象导致不相关基因重组编码融合mRNA最终翻译成融合蛋白，据此研究者推测远距离的内含子序列，如果包含反向重复互补序列，在基因重排过程中也可能相互接近导致反向剪接形成，产生重排或融合的环状RNA。
白血病中染色体易位重排现象非常常见，因此本文研究者选取了白血病为研究对象和模型。在展示该文结果之前，我们先了解下相关背景术语。
一、肿瘤细胞中染色体易位可产生环状RNA(f-circRNA)
APL患者中PML基因和RARa基因发生融合的现象非常普遍， APL患者骨髓起源的白血病细胞与健康人对照抽提RNA进行PCR实验，PCR产物测序验证了f-circRNA的存在。Divergent引物检测f-cricRNA的存在，convergent引物检测融合断裂点。breakpoint断裂点主要在PML基因的6号内含子和RARa基因的2号内含子区，针对断裂融合点区域设计反向PCR引物检测是否存在融合环状RNA（f-circRNA)的存在。
NB4细胞中PCR产物测序明确f-cricRNA剪接位点PML5号外显子和RARa6号外显子连接而成。THP1细胞中存在两个环状RNAf-circM9_1/2。实验结果表明白血病中基因组易位同样可影响环状RNA的形成，融合基因处可产生f-circRNA。
二、融合环状RNA具有一定促进细胞癌化作用
融合蛋白的产生往往是肿瘤发生的早期事件，那么融合环状RNA（f-cricRNA）是否在这个过程中发挥功能？
功能获得性实验
研究者选取MEFs（小鼠胚胎成纤维永生化细胞但不表达融合蛋白），构建f-cricRNA过表达逆转录病毒载体载体转染MEFs，细胞增殖和克隆形成实验结果显示f-cricRNA可以促进MEFs细胞增殖和克隆形成能力增强，细胞间的接触抑制能力减弱。
功能缺失性实验
针对f-cricRNA的接头序列设计siRNA干扰序列，构建shRNA载体转染MEFs细胞，发现shcircRNA可以抑制f-cricRNA的表达和逆转其促细胞的增殖能力和克隆形成能力。表明f-cricRNA可以独立于线性RNA发挥促肿瘤形成能力。
在构建f-cricRNA过表达载体时突变剪接供体位点碱基使之不能成环，是为f-cricRNA突变载体，转染细胞，功能实验表明突变f-cricRNA载体促增殖能力显著降低。
三、体内实验融合环状RNA可以促进白血病进程
那么融合环状RNA f-circM9是否足够促进造血干细胞向白血病转化？为了更直接地证明这个问题，研究者进行了小鼠体内实验。首先研究者在造血干细胞HSCs中过表达f-circM9，体外甲基纤维素培养一段时间后移植入非致死辐射小鼠体内，3个月时间，查看是否可以形成白血病小鼠，结果显示无一例小鼠诱发形成白血病。由此可见融合环状RNAf-circM9单独不足以促发白血病形成。这样的结果是可以接受的应该是合符情理的，f-circRNA伴随融合蛋白形成，他们很可能是协同作用。肿瘤在染色体易位的初次打击时，f-cricRNA与编码融合蛋白的线性RNA总是藕合的，研究者希望观测到f-circM9是如何与MLL/AF9融合蛋白相互关联的，首先构建MLL/AF9融合蛋白白血病小鼠模型。将MLL/AF9的cDNA序列构建到带GFP标签的逆转录病毒载体上，转染造血干细胞（HSCs）,过表达MLL/AF9融合蛋白的HSCs移植到非致死剂量辐射的小鼠体内，2个月后，MLL/AF9融合蛋白可以导致小鼠形成白血病。这里需要注意的是逆转录病毒过表达的是MLL/AF9的cDNA，意味着单独表达MLL/AF9融合蛋白，不会产生f-cricRNA。
收集模型小鼠的GFP标记的白血病细胞转染f-circM9过表达载体和空载，同时也转载f-circM9突变载体，并对细胞进行分类种植到甲基纤维素培养基中，培养5天后，评估各组细胞的增殖和克隆形成能力。
上述体内实验结果表明，融合环状RNA可协同其他致癌因素如融合蛋白促进肿瘤的发展。
四、融合环状RNA可增加肿瘤耐药性
无论是传统治疗还是靶向治疗都存在白血病复发现象，这无疑是白血病治疗最为关键和棘手的问题，白血病复发伴随的是药物耐受和治疗应答能力丧失。f-circRNA可以促进白血病细胞的增殖，是否保护肿瘤细胞避免肿瘤药物的致凋亡效果呢？为了回答这个问题，研究者还是基于上述的细胞模型和MLL/AF9小鼠模型进行研究，结果见下图
过表达融合环状RNA可以保护肿瘤耐受白血病药物的治疗作用，与治疗组相比，过表达f-circM9组的增殖和抗凋亡能力都要强。
五、内源性融合环状RNA对白血病细胞活力维持必不可少
THP1细胞质和细胞核中分开对f-circRNA检测发现，融合环状RNA主要存在细胞质中，放线菌素D处理细胞抑制RNA合成后，检测环状RNA和线性RNA的表达情况发现，融合环状RNA的稳定性比线性RNA分子更好。
接下来是敲低细胞内源性circRNA后，观察对shcircRNA对白血病细胞的功能影响。这里要关注的一个问题就是对circRNA干扰实验的三原则。现总结如下
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