环状RNA研究之“神雕侠侣”
环状RNA的研究最近几年正如火如荼的进行，涌现了一大批对人类认识环状产生较大贡献的科学家。从本期开始，我们将推出若干期的系列报道，总结一些在环状RNA研究领域有重要贡献的科学家的相关成果，以期能系统了解这些环状RNA研究的大牛们的事迹，发扬光大环状RNA的研究。
在第一期，我们将首先报道国内环状RNA研究首屈一指的科学家夫妻档：陈玲玲教授和杨力教授。
科学家简介：
图片来自《中国细胞生物学学报》2013, 35(2): 262–272
陈玲玲教授：现任上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所研究员，研究组长。主要从事RNA编辑和长非编码RNA对基因表达调控和干细胞命运决定的分子机制研究。
图片来自《中国细胞生物学学报》, 2014, 36(11): 1455–1459
杨力教授：中国科学院–德国马普学会计算生物学伙伴研究所研究员。2012年入选中科院百人计划。开创性地建立全新转录组分析流程体系, 系统揭示了多种特殊结构新型长非编码RNA在体内的广泛存在及其功能预测。（以上两部分内容来自于《中国细胞生物学学报》及网络，略有改动，非原创内容）
陈玲玲教授与杨力教授合作发表了众多的环状RNA研究论文，数量和影响力都非常大，是目前环状RNA研究领域最活跃的团队之一。
发现了环状RNA参与调控基因转录过程，发现了反向互补RNA序列在环状RNA形成过程中的作用，提出了基于反向Alu序列及其他反向互补序列的环状RNA形成模型，提出了基于环状RNA的假基因形成模型。
他们夫妻的合作为环状RNA研究做出了巨大的贡献，在环状RNA形成机制和功能研究方面均有巨大贡献。他们的环状RNA方面的研究工作基本都是合作完成的，因此我们将陈玲玲教授与杨力教授一起介绍。
重要环状RNA研究成果介绍：
1. 首次系统分析环状RNA形成机制，提出了内含子中反向互补序列促进环状RNA形成的机制模型：
该文在分析人胚胎干细胞系H9的poly(A)–/Ribo–及RNase R消化的poly(A)–/Ribo– 的RNA样品RNA-Seq数据得到了一大批反向拼接的RNA产物，最终得到了1662种环状RNA，其中有12%的环状RNA为H9细胞中独有的。
首次提出并通过实验验证了内含子区存在的反向互补RNA序列是驱动形成环状RNA的重要原因。反向Alu元件（IRAlu）已成为预测和分析环状RNA形成机制的重要依据1。
该文献是环状RNA研究领域中的重量级成果之一，所提出的环状RNA形成机制模型获得了学术界的高度认可。
2.带有内含子序列的环状RNA（ciRNA）参与调控基因转录过程：
该研究结果发现了环状RNA的一类重要功能：参与调控基因转录作用过程。研究者探索了内含子形成的环状RNA（ciRNA）的功能，发现大部分ciRNA定位于细胞核内，几乎没有miRNA结合的功能，但有趣的是将ciRNA敲低，却会阻碍对应的基因转录的过程。
研究选取ci-ankrd52为研究对象，发现该ciRNA会大量富集于该基因的转录起始区，促进了RNA聚合酶II的功能。初步证明了带有内含子序列的环状RNA的功能是促进所对应的基因转录的活动。
该文是环状RNA功能研究的重要成果，是miRNA Sponge之外的环状RNA最重要的功能模型2。
3.环状RNA驱动假基因的形成：
这是一篇Cell Research杂志的Letter，讲述了一个非常有趣的现象：他们发现了在基因组中存在一些从环状RNA反转录后整合形成的假基因。
研究者首先想到稳定的环状RNA分子有没有可能被反转录并整合进入基因组中（独特的思考问题角度），随即设计了一个分析环状RNA来源的假基因分析流程，称之为CIRCpseudo。
一开始，作者分析了小鼠基因组中与circRFWD2对应的环化位点（外显子6—外显子2），在小鼠的全基因组中找到了33个“高可信度的circRFWD2来源假基因”，由于环状RNA反转产生的cDNA未必全包含环化位点，基因组整合过程也未必恰巧将环化位点整合进去，因此有些环状RNA来源的假基因可能并不包含环化位点，于是作者又分析了包含外显子2至6中间的外显子区的假基因，符合这样的条件的有9个，称为“低可信度的circRFWD2来源假基因”，同时作者也找到了6个包含circRFWD2之外的外显子区序列的假基因。
LINE-1介导的RNA反转录通常需要有Poly (A)的存在，在所有42个circRFWD2相关的假基因中39个不存在Poly (A)序列，说明他们可能是以未知的方式反转录为cDNA并整合至基因组的。除了circRFWD2之外，还有别的环状RNA来源假基因的情况，比如circSATB1来源的假基因存在所有已知的小鼠品系基因组中，而circDIAP3来源的假基因却只在部分品系中存在。
在灵长类中，人类基因组中找到的circPRKDC和circCAMSAP1来源的假基因在大猩猩和黑猩猩中存在，但恒河猴中不存在。有趣的是在小鼠MEL和G1E细胞系中发现了在一个circSATB1来源的假基因区存在CTCF结合位点，而对应的SATB1基因外显子区没有，在人类基因组中也没有发现类似的情况3。
本文从全新的角度分析了环状RNA的功能，非常有趣。这也提醒我们在进行环状RNA研究的时候要当心来自环状RNA形成的假基因对实验结果的干扰。
前不久，他们的又一力作发表于Cell Reports杂志上，探索了环状RNA形成早期的基本规律。之前的环状RNA研究报道均是组学水平的研究结果，由于环状RNA相对稳定的特点，可以在一定时间内实现积累，而环状RNA如何形成，形成速率怎样还是个未解之谜。
在该文中，作者用了一种基于标记的测序技术，专门富集新转录形成的RNA进行分析。该技术称为4sUDRB sequencing (4sUDRB-seq)，概括而言，就是首先用DRB（5,6-dichloro-1--d-ribofuranosylbenzimidazole，5,6-二氯-1--D-呋喃核糖苯并咪唑）处理细胞，抑制RNA聚合酶II（PA1细胞中处理3个小时即可），去掉DRB的同时加上4sU，这样新生成的RNA中即掺入4sU，然后通过HPDP-biotin（N-[6-(Biotinamido)hexyl]-3’-(2’- pyridyldithio)propionamide）纯化。为防止HPDP-biotin干扰或影响4sU标记环状RNA形成过程和纯化得率，作者通过体外过表达体系进行了验证分析，表明该套系统不会影响环状RNA的形成，也不会降低对4sU标记环状RNA回收效率。
利用该体系，作者发现环状RNA的形成速率其实是非常低的，形成过程与聚合酶II的快速延伸有关。以神经元为例，环状RNA的富集依赖于其中的快速转录过程和长时间积累效应4。本文首次对环状RNA形成过程进行探索研究，表明环状RNA的形成是快速转录活动，其中的顺式元件（RNA内部的反向互补序列）以及细胞内长时间积累效应共同决定的。本文也为目前已报道的众多疾病和生理过程相关的环状RNA形成机制提供了很好的思路借鉴。
5.环状RNA形成机制的综述：
陈玲玲教授在Nature Review Molecular Cell Biology做了一篇环状RNA生成机制和主要功能的综述，系统总结了环状RNA的主要研究进展。环状RNA形成机制方面，目前已知的模型主要有：1) 剪切体介导的环状RNA形成；2) 反向互补序列介导的环状RNA形成；3) RNA结合蛋白介导的环状RNA形成，典型的有黑腹果蝇中Mbl介导的环状RNA形成以及QKI介导的环状RNA形成。环状RNA功能方面，目前最主要的是环状RNA作为miRNA Sponge的模型。此外，包含内含子序列的ciRNA或EIciRNA会影响对应基因的转录过程。
参考文献
1.Zhang, X. O. et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell 159, 134-147, doi:10.1016/j.cell.2014.09.001 (2014).
2.Zhang, Y. et al. Circular intronic long noncoding RNAs. Mol Cell 51, 792-806, doi:10.1016/j.molcel.2013.08.017 (2013).
3.Dong, R. et al. CircRNA-derived pseudogenes. Cell Res, doi:10.1038/cr.2016.42 (2016).
4.Zhang, Y. et al. The Biogenesis of Nascent Circular RNAs. Cell Rep 15, 611-624, doi:10.1016/j.celrep.2016.03.058 (2016).
陈玲玲教授实验室主页：http://www.chenlab-ncrna.com/index
杨力教授实验室主页：http://www.picb.ac.cn/rnomics/yanglab/index
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