环状RNA定量PCR技术详解

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环状RNA研究正在全世界如火如荼的进行，各种针对环状RNA检测的技术方法也不断出现，其中对特定环状RNA进行定量分析是环状RNA研究中必须要解决的问题。今天山人就跟大家一起分享一下环状RNA定量分析的技术要点。（注：本文定量PCR技术以染料法为主，TaqMan探针法暂不做介绍，不便之处敬请谅解。）

实验设计与样品准备：

首先，我在此向各位读者表示诚挚的歉意，在上一期的《环状RNA实验流程详解》中，我因为不严谨，导致有个实验细节写错了，非常抱歉！在此，山人也向各位读者郑重承诺，以后一定尽量不再犯同样的错误。更正后的内容如下：

进行RNase R消化：获得的RNA样品用52μL DEPC水重悬，一分为二，其中一份进行RNase R消化，另一份做对照。RNase R消化组加3μL 10×RNase R Reaction Buffer，1μL RNase R (20 U/μl)，（不消化的组加1μLDEPC水），37 °C for 1–2 h。消化结束后加30μL 酚-氯仿-异戊醇，震荡混匀以终止消化，13000× g， 4 °C 离心 5 min。上清转移至新的RNase Free的离心管中，用6μL 4 M氯化锂，1μL糖原，90μL预冷无水乙醇颠倒重悬，−80 °C沉淀1h，也可以直接放置在−80 °C，直到准备下一步实验时。实验前用13000× g， 4 °C 离心 20 min，用75%预冷乙醇洗涤两次，风干后20μLDEPC水溶解即可用于下一步的实验。

进行环状RNA定量PCR分析，对照组的选择比较重要，需要考虑各个主要实验步骤中可能存在的干扰因素：

首先，需要进行RNase R消化与不消化处理的对照。这个对照的目的是排除线性RNA中可能存在的能被所设计的环状RNA定量PCR引物扩增的干扰序列。

其次，建议增加不反转的对照或增加DNase I消化条件。因为RNA提取过程中很难完全避免DNA的污染，因此在进行定量PCR实验过程中还需要排除DNA序列污染的可能性，增加DNase I消化并加上不反转的RNA样品直接作为模板的对照即可清除的排除这一潜在干扰条件。

再次，需要考虑内参的选择问题。环状RNA的定量一般会与对应的线性RNA进行比较，因此不同环状RNA的含量高低很难有统一的内参，尤其是各个实验体系中稳定表达的环状RNA还没有明确的定论。关于如何选择内参这个问题，山人的愚见是间接的通过与线性RNA表达量进行比较，线性RNA研究相对成熟，也有认可度较高的内参，在实验设计过程中不经过RNase R消化的组可以直接用常规内参进行定量比较，同样的样品经过RNase R消化后不同基因所对应的环状RNA含量比例可以假设是不受影响的，这样就可以基于线性RNA的内参数据进行间接的环状RNA定量分析。

最后，需要考虑可能存在的环状RNA非线性反转录扩增的可能性。如下图所示，环状RNA特殊的结构导致它可能会被以“滚环”方式进行非线性的反转录扩增，这样的cDNA中同时具有多个环化位点的序列，因此定量PCR的结果可能会被放大。这样的情况可以通过PCR产物电泳和条带分离鉴定甄别。这个问题或许也可以考虑通过优化反转录条件（引入特异性引物进行反转录？）或选择反转录过程中消化RNA模板能力更强的反转录酶进行优化。

图1 环状RNA分析引物扩增获得多条带原因的理论分析模型（来自 (Barrett and Salzman, 2016)）

引物设计：

目前认为环状RNA是RNA剪切过程中反向拼接后形成的，环状RNA与所对应的线性RNA最大的差别在环化位点周围。这极大的限制了环状RNA的定量PCR引物设计。因此环状RNA定量PCR引物核心是保证特异性，尽量符合定量PCR基本要求。引物设计主要原则如下：

引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点扩增。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度，产物长度，序列Tm值，引物与模板形成双链的内部稳定性，形成引物二聚体及发夹结构的能值，在错配位点的引发效率，引物及产物的GC含量等等。 

1）引物的长度一般为15-25 bp，常用的是18-23 bp，不建议大于30bp，因为过长会导致其退火温度过高，不适于定量PCR反应。

2） 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。引物内部及引物之间最好不要有超过4个碱基的连续互补序列。

3）引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 

4）引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 

6）定量PCR扩增片段长度一般在80-150bp为宜，产物尽量不要有二级结构，碱基尽量随进分布，避免局部GC含量过高的情况，扩增片段总GC含量尽量不要超过60%。

常用软件：

软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。 

此外，最近的一些报道表明环状RNA中还可能存在特殊的RNA拼接机制，因此除了环化位点，对于那些清楚的知悉完整序列的环状RNA分子中或许还有可能设计出环状RNA特有序列的定量PCR引物。目前还没有这一类的定量PCR引物报道，但理论上是完全可行的，大家值得一试。

PCR实验流程：

定量PCR的体系一般都是2×的预混液，反应体系只需要补充引物和模板即可，一般引物浓度100-400mM，模板依据具体实验优化，建议内参Ct值在15-20之间为佳。为减少操作误差，一般会用三个复孔进行实验。PCR条件依据所选择的定量PCR 试剂说明书进行。最后用程序默认设置进行溶剂曲线测定。

为保持实验体系稳定，建议尽量减少预混体系的反复冻融次数，实验过程中尽量避免强光直接照射样品和预混液。

结果分析与常见问题释疑：

影响Ct值的主要因素：1. 模板浓度；2. 反应体系成分，如pH，盐浓度等；3. PCR扩增效率，理论上每个循环会获得扩增2倍的模板，但实际会因为各种原因或多或少偏离这一理想状态，严谨的实验需要进行引物和体系扩增效率预实验，一般会平行做三次5个数量级以上稀释倍数的模板浓度梯度分析，扩增效率在90-110%的范围内属于比较理想的情况。具体QPCR拷贝数计算不在此做详述。

常见问题：

1. 没有Ct值：在溶解曲线中没有“起峰”。首先考虑手否由于模板降解或浓度太低所导致，还有可能是仪器参数设置有误导致的。

2. Ct值太大：首先考虑是否模板浓度不恰当所致，也可能是引物或模板降解，还有可能是扩增片段太大导致的。

3. 阴性对照有Ct值读数：首先考虑反应体系污染的可能，实验环境尤其是移液枪内部如果曾有模板物质的污染，非常有可能引入假阳性信号，如遇到这类情况建议清洗或更换相关实验用品，也可在定量PCR体系中引入尿嘧啶糖苷酶体系避免污染后续实验。

4. 溶解曲线出现多个峰：最有可能的是引物特异性不够或二聚体及发夹结构等造成的。此外也可能是引物浓度，镁离子浓度不佳所致，还有可能是基因组污染导致。

5. 溶解曲线异常，如S形等奇特的形状：可以考虑是否由于设备参数中染料选择不正确或者反应体系中染料被漂白失活等因素。

数字PCR对环状RNA研究的价值：

定量PCR检测是生命科学研究的重要基本实验技术，除了燃料法和探针法的定量PCR技术，一些新兴的定量分析技术也非常值得关注。其中数字PCR就特别有用。

目前市面上有两种数字PCR体系：BioRad的微滴式数字PCR体系以及Thermo的基于芯片微室的数字PCR体系。数字PCR基本原理是利用物理学方法结合合适的稀释条件使得每个扩增单元中含有尽量少的模板，理论上可以有一个模板分子或者没有。这样在每个扩增单元中都要么通过高循环数的扩增，从单个模板扩增得到有明确信号的产物，或者因为没有模板而呈现阴性信号，最终在检测器中读出有阳性信号的扩增单元数目，这样就可以实现绝对定量。BioRad的微滴式数字PCR体系构建单个扩增单元是基于“油包水”的小微滴实现，Thermo的数字PCR体系则是在芯片中构建隔离的微室作为扩增单元。两种体系各有优劣，在此不做详细分析。

数字PCR对于环状RNA的研究非常有价值，这种定量PCR技术理论上可以实现绝对定量，对引物和扩增片段的要求比常规的定量PCR要低很多，因此可以大大提高引物和扩增片段的选择空间，这对于环状RNA的定量分析非常有益。

参考文献：

Barrett, S.P., and Salzman, J. (2016). Circular RNAs: analysis, expression and potential functions. Development 143, 1838-1847.

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