陈玲玲课题组发现新型lncRNA
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10月27日,知名杂志MolecularCell在线发表了陈玲玲课题组的一项重要研究成果,报道发现了一种新型的RNA转录加工产物:SPA及其分子机制。SPA是一种新型的lncRNA,它的5’端为snoRNA,3’端为Poly(A)(Huang Wu et al. 2016)。文中系统分析了SPA形成机制,分子细胞生物学作用机制并探讨了PWS病人中SPA如何发挥作用的。
备注:
1.常规mRNA前体加工过程:
常规的真核生物mRNA加工过程包含三个步骤:5’加帽,外显子拼接和3’加Poly(A)。其中3’加Poly(A)过程在Pol-II转录到终止子序列时,CPSFs识别AAUAAA短序列(个别情况下序列可能略有差别),下游还通常会有富含G/U的序列原件协助,对mRNA前体产物进行切割和加Poly(A)(Mandel et al., 2006),后面剩余的RNA转录产物由于存在5’磷酸基团而十分不稳定,可被核酸外切酶XRN2等识别并降解掉。
2.什么是snoRNA?
snoRNA是存在于核仁或Cajal bodies的一类重要的RNA分子,与细胞核小RNA(snRNA)和核糖体RNA(rRNA)的加工修饰过程有关。大部分snoRNA是由基因内含子区编码的,往往一个snoRNA对应于一个内含子。snoRNA分为两大类:Box C/D snoRNAs和Box H/ACA snoRNAs。Box C/D snoRNAs包含四个蛋白:Fibrillarin (Fib)、Nop56、Nop58和15.5k。当一个内含子包含了两个snoRNA基因序列的时候就可能会形成Sno-lncRNAs,这类lncRNA没有5’加帽和3’加Poly(A)(Yin et al., 2012)。在人类胚胎干细胞中,最主要的形成Sno-lncRNAs的基因区域在PWS病人中存在缺失性突变。
3.什么是Prader-Willi syndrome(PWS)?
PWS是一类遗传性神经发育异常疾病,临床表现为神经系统发育异常、激素分泌失衡、肥胖、智力低下等。遗传关联定位分析表明PWS相关的突变为SNURF-SNRPN基因的3’UTR区的一小段基因缺失突变,基因座区位于15q11-q13。这一缺失突变导致PWS病人出现snoRNA和lncRNA表达异常。
SPA是如何发现的?
由于PWS病人缺失的区域有大量的snoRNA基因编码,自然会想到如果用snoRNA相关的蛋白进行RIP实验就可能会发现PWS相关的lncRNA。作者正是基于这一想法开展本项工作的。作者用抗Fib的抗体进行RIP实验,所收集到的RNA产物进行二代测序(Fib-RIP-seq),从这一实验的产物中,作者意外的发现了两个SPA产物:包含5’端snoRNA和3’端Poly(A)的一种新型的lncRNA!作者分别将其命名为SPA1和SPA2。SPA1的5’端为SNORD107,有7个外显子,长度约34000nt。作者接下来分别用Northern实验,RIP-QPCR实验,反义核苷酸干扰实验,m7G帽子结构的抗体鉴定及Poly(A)(+)组分分离等实验体系鉴定了所发现的两个SPA分子的主要特征。
图1 SPA发现与鉴定实验(来自(Huang Wu et al. 2016))
(A) Fib-RIP-seq发现了SPA1和SPA2,两种特殊lncRNA的定位示意图。
(B) SPA1的序列特征。
(C) Northern实验,所设计的探针C杂出了SPA1,分子量约34000nt。
(D) 双硫代磷酸修饰的反义寡脱氧核苷酸(ASO)可明显降低SPA1的含量。
(E) Fib-RIP中QPCR验证SPA1/2的确与Fib相互作用。
(F) m7G帽子结构的抗体不能结合SPA1/2。
(G) SPA1/2存在于Poly(A)(+)组分中。
SPA是如何形成的?
常规的聚合酶II转录产物往往带有5’帽子结构,从上面的实验中,作者却发现SPA1/2不带有5’帽子结构!于是作者就想知道SPA分子是如何形成的。作者在不表达SNURF-SNRPN基因和SPA的Hela细胞中通过设计构建载体进行了SPA形成机制的研究。作者基于SPA形成区域的基因结构特征,设计了一系列的载体进行SPA形成相关基因序列的排查分析。所设计的载体包含了SNURF-SNRPN基因后侧的外显子(9和10,E9/E10),随后的Poly(A)信号元件,SNURF-SNRPN与SPA基因间序列3.4Kb,其中包含了SNORD107(SPA1的5’端结构),后面是Poly(A)信号元件。作者推测从这一载体上可以产生一个5000nt的RNA前体产物以及500nt的前端产物(e9+e10,模拟前端的SNURF-SNRPN基因mRNA产物)和800nt的后端产物(SPA1,模拟内源性SPA1)。Northern实验证实了这一推测,也证明所设计的载体符合预期。在这一载体的基础上,删除SNORD107 或者它的box C,box C’/D motifs(对应于图中2-5泳道)均能明显的影响SPA1的形成,对e9+e10没有影响。而如果将SNORD107更换为另一种box C/D类的snoRNA:SNORD116-13或者box H/ACA类的snoRNA:SNORA5C均不影响SPA1的形成。这些说明5’的snoRNA对于SPA1的形成非常重要。
图2 snoRNA对于SPA的形成至关重要
(来自(Huang Wu et al. 2016))
由于SPA1和上游的SNURF-SNRPN基因为同一启动子启动转录的,因此作者推测SNURF-SNRPN基因的Poly(A)加工信号势必对SPA1的形成有调控作用。因此作者设计了一系列的SNURF-SNRPN基因的Poly(A)加工信号突变体,包括删除AAUAAA信号(泳道2),XRN2切割信号(泳道3),或者两者一起删除(泳道4),这些突变设计军严重影响上游e9+e10的加工成熟,SPA1的生成方面,越多的RNA加工前体越容易形成更多的SPA1产物。而如果将中间的3.4Kb的间隔序列完全删除(泳道5),e9+e10无法形成正确的产物,SPA1的形成也受到了抑制。而如果将上游的Poly(A)加工信号更换为效率更强的BGH基因Poly(A)加工信号(泳道6),上游的e9+e10形成左右明显加强,但SPA1却完全无法形成了。这些结果说明SPA1的形成需要上游基因相对弱的Poly(A)加工信号。
图3 上游基因的Poly(A)加工信号对SPA形成的影响
(来自(Huang Wu et al. 2016))
Poly(A)加工过程包含了在加工信号的特定位点将转录产物切开的过程,切开后前面的产物被继续加Poly(A),后面剩余的产物由于带有5’磷酸基团,会被CPSF73、CPSF30以及XRN2等外切核酸酶降解掉。在SPA1形成的过程中,SPA1与上游基因是同一转录产物上的,是何种机制导致SPA1形成而不是被降解掉是接下来需要解释的问题。作者在PA1细胞中对CPSF73和CPSF30基因进行了Knock-Down实验,结果表明干扰CPSF73和CPSF30会导致SPA1前体分子的聚集,XRN2的实验结果也与此相似。这说明SPA1的形成过程还是需要这些核酸外切酶的作用的。这里就出现了一个矛盾的问题:这些外切核酸酶是如何只影响SPA1前体的加工,而不会直接降解掉SPA1的?在这一情形下为何RNA聚合酶II没有终止转录作用?
作者检测了这一区域RNA聚合酶II的转录速度,发现这一区域的转录速度(3.4Kb/min)明显高于平均速度(2.5Kb/min),因此在这一区域,RNA聚合酶会在XRN2彻底消化RNA之前到达snoRNA的区域,snoRNA可以阻止XRN2的降解活动。作者通过在PA1细胞中表达不同突变形式的Pol-II突变体验证了这一假设。
图4 SPA1形成机制模型(来自(Huang Wu et al. 2016))
SPA在细胞内如何发挥作用的?
作者首先分析了SPA1/2在人的胚胎干细胞细胞系H9中的表达情况,证明它们是丰度较高的lncRNA,同时之前文献报道的sno-lncRNA的含量也很高(Yin et al., 2012)。作者在H9细胞中进行了FISH原位杂交研究,证明SPA1/2和sno-lncRNA均定位于细胞核内。
图5 SPA1/2定位于细胞核中(来自(Huang Wu et al. 2016))
由于目前所构建的小鼠模型均没有完全模拟出人类的疾病特征,作者选择利用CRISPR-Cas9技术进行基因打靶构建细胞模型。经过筛选,作者获得了单条染色体敲除了141Kb的克隆株(H9 P-KO)。这一敲除株依然可以维持多能性,核型稳定,也可以分化为三种胚层的细胞类型,细胞整体的表达谱与H9几乎没有差别。作者构建1-2Kb的生物素标记的正义和反义探针序列,对SPA进行RNA Pull-Down分析,钓取到了三个相互作用蛋白:TDP43, RBFOX2和hnRNP M。进一步的RNA Pull-Down分析证明SPA2 及 sno-lncRNAs都与TDP43, RBFOX2和hnRNP M有相互作用。作者也用超高分辨率光学显微镜分析了这些蛋白与RNA的空间定位。
图6 PWS区域有多种相互作用蛋白
(来自(Huang Wu et al. 2016))
接下来,作者用UV交联后免疫沉淀(iCLIP)实验分析了TDP43, RBFOX2和hnRNP M与RNA相互作用的位点,结果表明与相关研究的结论一致,TDP43结合UG-rich 序列,RBFOX2结合UGCAU 和 GCAUG 序列,hnRNPM 结合成簇的GU-rich 序列(常含有UU motif),进一步借助超高分辨率显微镜表明SPA和sno-lncRNAs对三种蛋白的结合作用略有不同,有一定的偏好性。
图7 iCLIP实验分析相互作用motif
(来自(Huang Wu et al. 2016))
在作者所构建的PWS区域敲除株H9 P-KO中,作者分析了其中的RNA选择性剪接的情况,结果表明敲除了PWS区域后RNA选择性剪接的情况有非常明显的变化,在WT和P-KOP的H9中,共鉴定到348种发生改变的RNA可变剪接作用,很多对应于TDP43 或RBFOX2,而对应于hnRNP M的却很少。这些可变剪接在正常的hES中也存在。这表明SPA和sno-lncRNAs通过影响相互作用蛋白的定位而影响细胞内RNA加工过程。这或许为最终揭示PWS综合症提供了重要的线索。
图8 缺失PWS的hES细胞中RNA加工及RBP结合mRNA前体的状态异常(来自(Huang Wu et al. 2016))
总之,本文的工作非常严谨,为大家提供了非常棒的学习资料。本文从RIP实验入手发现了奇怪的RNA分子:SPA,接着分别探索了SPA的形成机制和细胞定位,也做了敲除实验,系统分析其分子作用机制。借助RNA Pull-down实验筛选到了SPA相互作用的蛋白分子,并结合敲除体系,最终揭示了完整的故事。由此不难看出,筛选鉴定相互作用分子的技术体系在RNA研究中具有特别重要的价值!将RIP和RNA Pull-down以及iCLIP等RNA相互作用分析技术灵活运用是RNA研究的重要工具,非常值得大家学习借鉴。此外,在环状RNA加工的过程中是否也存在类似SPA的转录调控机制也值得思考。
参考文献:
Huang Wu, Qing-Fei Yin, Zheng Luo, Run-Wen Yao, Chuan-Chuan Zheng, Jun Zhang, Jian-Feng Xiang,Li Yang, and Ling-Ling Chen (2016). Unusual Processing Generates SPA LncRNAsthat Sequester Multiple RNA Binding Proteins. Molecular Cell, Published Online.
Mandel, C.R., Kaneko, S., Zhang, H.L., Gebauer, D., Vethantham, V., Manley, J.L., and Tong, L. (2006). Polyadenylation factor CPSF-73 is the pre-mRNA 3 '-end-processing endonuclease. Nature 444, 953-956.
Yin, Q.F., Yang, L., Zhang, Y., Xiang, J.F., Wu, Y.W., Carmichael, G.G., and Chen, L.L. (2012). Long noncoding RNAs with snoRNA ends. Mol Cell 48, 219-230.