深度长文（上）｜2016年环状RNA研究进展盘点

      HAPPY      

2017

  NEW YEAR  

声  明

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        首先祝大家元旦快乐！在过去的一年里环状RNA取得了很多重要的研究进展，借此跨年之际，山人详细总结了2016年环状RNA的主要研究进展，梳理了一下环状RNA主要研究方向的进展和依然没有解决的问题，希望能对各位同仁今后的环状RNA研究有所帮助。下面将分别从环状RNA形成机制、分子功能、疾病和生理活动相关性、研究方法等方面分别盘点，最后总结一下环状RNA还有哪些重要的科学问题有待进一步探索。

一

环状RNA形成机制研究进展

        环状RNA的形成机制是环状RNA研究中基本的科学问题之一，环状RNA形成机制方面，目前已知的模型主要有：1) 剪切体介导的环状RNA形成；2) 反向互补序列介导的环状RNA形成；3) RNA结合蛋白介导的环状RNA形成，典型的有黑腹果蝇中Mbl介导的环状RNA形成以及QKI介导的环状RNA形成。剪切体是环状RNA形成过程所必须的。环状RNA形成机制的基本模型已经初步成型，但一些具体的问题还没有解决，比如环状RNA形成过程的动力学变化过程是怎样的？环状RNA形成过程与所对应的线性RNA在转录过程中是怎样的关系？ 同一基因不同的环状RNA产物之间的关系是怎样的？环状RNA形成过程如何精确调控的？等等。2016年在环状RNA形成机制方面有一些新的进展，主要的包括：新生环状RNA生成的动力学机制，环状RNA存在可变剪切，细胞因子对环状RNA表达的影响，扩张型心肌病特异性环状RNA形成机制，植物中发现的非GT/AG规则的RNA拼接作用机制的研究报道。这些研究工作丰富了我们对环状RNA形成机制的认识。

1.1 新生环状RNA生成的动力学机制

        4月19日，陈玲玲教授和杨力教授作为共同通讯作者在Cell Reports杂志发表了题为“The Biogenesis of Nascent Circular RNAs”的重要文章，介绍了利用4sUDRB脉冲标记后测序的技术检测环状RNA形成的动态过程，探索了环状RNA形成早期的基本规律(Zhang et al., 2016b)。本文的结果表明环状RNA的形成是快速转录活动，其中的顺式元件（RNA内部的反向互补序列）以及细胞内长时间积累效应共同决定的，初步揭示了环状RNA形成过程的动力学变化过程。

1.2 环状RNA中也存在可变剪切

        6月28日，中国科学院北京生命科学研究院计算基因组实验室赵方庆教授团队在国际知名杂志Nature Communication发表论文，利用环状RNA预测分析结合长片段测序技术，首次实现了针对环状RNA可变剪切状态进行了系统研究(Gao et al., 2016)。环状RNA本身就是可变剪切的产物，但每个环状RNA分子内部是否仍有可变剪切方式？环状RNA的二级结构如何？这些都是非常有趣的问题。赵方庆教授团队基于该问题，设计了一种新的整合环状RNA结构与序列信息的技术分析流程，作者称之为CIRI-AS。基于此技术，作者在10种人类细胞以及62个果蝇不同组织来源的样品中分析了环状RNA可变剪切的情况，结果表明理论上的四大类可变剪切方式在环状RNA中均普遍存在。这一发现大大增进了对环状RNA的认识，也为环状RNA研究提供了新思路和新工具。

        几乎同一时间，陈玲玲教授与杨力教授合作发表了一项环状RNA可变剪切研究的重要成果，相关成果于6月30日在线发表于Genome Research杂志(Zhang et al., 2016a)。与赵方庆教授的文章结论一致，四种理论上的可变剪切方式均存在。5’或3’选择近端或远端拼接位点会因细胞类型不同而有巨大差异，这说明环状RNA的形成与可变剪切方式与细胞类型关系非常密切。作者也通过信息分析结合体外表达验证的思路针对环状RNA环化位点周围的反向互补序列对可变剪切的影响进行了分析，结果表明反向互补序列的分布的确能影响环状RNA的可变剪切形式。作者在分析环状RNA可变剪切序列所对应的外显子序列中，发现了数千种环状RNA独有的外显子！它们无法直接与已注释的线性RNA中存在的外显子序列匹配，也不是完整的内含子序列，而是新形式的外显子！这类外显子的保守性明显低于已注释的外显子，在不同细胞中呈现高度多样性，个别的能在多种细胞中同时检测到。这说明RNA可变剪切方面还有很多未知的机制需要进一步的研究。

        除了上述两个关于环状RNA存在可变剪切的研究工作，还有一些研究报道中佐证了环状RNA存在可变剪切的现象。10月13日，PLoS One在线发表了圣犹达儿童医学研究院Charles Gawad教授团队的一项研究成果，探索了ASXL1基因环状RNA表达特征，用到了单细胞测序技术进行环状RNA和线性RNA表达状态的分析，结果表明单细胞中环状RNA等表达状态呈现高度的异质性特征(Koh et al., 2016)。从另一个角度证实了环状RNA形成过程的高度复杂性。10月13日，International Journal of Molecular Sciences杂志在线发表了日本先进科学研究所的Hitoshi Suzuki教授和他的团队的一项研究成果，报道杜氏肌营养不良突变热点位点存在RNA拼接多态性，也存在反向拼接的环状RNA(Du et al., 2016)。杜氏肌营养不良（DMD）是一类严重的骨骼肌系统疾病，有报道表明DMD基因的外显子45-55区跳跃拼接（multiple exon skipping，MES)后可能对DMD病情控制有帮助。作者通过构建DMD基因44-56外显子区对应的基因组序列表达载体，分析了其中RNA剪接作用情况。作者共发现了8种不同的外显子跳跃拼接产物。作者还发现上游内含子可以作为远端拼接的供体与下游条与拼接位点内含子发生互作，进而形成跳跃拼接的产物。在该位点，作者也鉴定到了反向拼接的情形，因此也可形成环状RNA。这项研究报道也可作为环状RNA存在可变剪切方式的证据。

1.3 细胞因子对环状RNA表达的影响

        2月18日，Nucleic Acids Research发表了以色列魏茨曼科学研究所Yosef Yarden教授的研究论文，介绍发现EGF诱导后环状RNA比mRNA和miRNA更稳定存在。用EGF刺激人的乳腺上皮细胞后mRNA和miRNA均有大幅度的升高，但几分钟后就迅速下降，但环状RNA的表达变化不明显。环状RNA比线性的RNA更稳定，但表达量很低。可以表达环状RNA的基因所对应的启动子比没有环状RNA的基因启动子要活跃得多。

1.4 RBM20调控心肌中一类特殊环状RNA的形成

        8月16日，循环学顶级杂志Circulation Research杂志在线发表了一项重要的环状RNA研究最新成果，该论文的通讯作者是荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心的Esther E. Creemers教授和Yigal M. Pinto教授。本文介绍发现了扩张型心肌病重要的致病基因RBM20参与调控了Titin基因一类特殊环状RNA形成的过程(Khan et al., 2016)。这项研究为揭示特定环状RNA的形成机制提供了很好的借鉴。

1.5 植物中发现非GT/AG规则的RNA拼接作用，也可形成环状RNA

        9月29日，FEBS Lett. 杂志在线发表了南京农业大学赵弘巍教授和他的团队发表的环状RNA研究论文，从拟南芥的转录组学数据中找到一类特殊的环状RNA分子，他们环化过程中不服从GT-AG规则 (Xiaoyong Sun et al. 2016)。作者从16个拟南芥转录组数据中分析到803种环状RNA，综合而言，这些环状RNA有以下几个特点：（1）序列结构分为经典形式和非经典形式（不符合GT-AG拼接规则的RNA拼接环化产物）；（2）叶绿体是环状RNA形成的热点；（3）互补序列不仅存在于内含子中，还可存在于拼接位点区域。这些特征与动物中差别较大。叶绿体中大量存在环状RNA的现象也非常有趣。

        
        10月14日，RNA Biology杂志在线发表了浙江大学Ye Chu-Yu和中国农业科学院水稻研究所Guo Longbiao共同通讯作者的研究成果，发现在水稻中存在不依赖GT/AG规则拼接形成的环状RNA(Dou et al., 2016)。文中作者巧妙的利用分析过程中筛选到的覆盖反向拼接位点的双尾测序Reads分析所涉及的环状RNA的序列特征。作者在去除核糖体RNA和RNase R消化后的RNA样品测序结果中共鉴定到大约3000个左右的环状RNA，分析这些环状RNA的序列特征的时候，作者意外的发现了在水稻中存在一大类不符合GT/AG拼接规则的RNA拼接产物(Dou et al., 2016)。这类拼接作用在上个月的另一个拟南芥的研究报道中也发现过，但目前这类奇特的现象还仅限于植物来源的样本，哺乳动物中暂未发现。具体机制还有待进一步探索。

1.6 内含子区的构象与热力学特征环状RNA形成的影响研究

        2月5日，Computational Biology and Chemistry杂志发表了西安交通大学电信学院自动化系韩九强教授为通讯作者的文章，介绍利用信息学计算模拟的方法分析了环状RNA形成所涉及的内含子（flanking introns）在构象和热力学方面的特征，认为形成环状RNA的内含子构象和热力学特征均有助于环状RNA的形成。本文为环状RNA形成机制的数学模型构建提供了很好的思路。也暗示环状RNA形成所涉及的flanking introns或许还有其他尚未引起学术界重视的特征。

1.7 环状RNA形成机制仍未解决的问题

        目前已发表的环状RNA形成过程的研究让我们对环状RNA的形成过程有了大致的了解，概括而言，环状RNA形成过程是与线性RNA转录过程是并行的，环状RNA形成过程与对应基因的转录速度有关，RNA内部的顺式元件（反向互补序列或RBP结合序列等）是形成环状RNA的重要前提。同一基因可能对应于多种环状RNA分子形式，环状RNA本身也存在可变剪切，甚至会携带与线性基因不同的全新外显子，部分组织或疾病特异性的环状RNA形成过程是受到精确调控的。

        环状RNA研究总体已从大规模组学分析筛选向特定环状RNA分子过渡。具体到特定的环状RNA，其形成机制依然面临诸多问题，包括特定的环状RNA形成的条件，动力学过程，与对应基因的其他线性RNA和环状RNA之间的关系等。针对特定环状RNA的形成机制应该会是接下来环状RNA形成机制研究的重点方向。环状RNA形成过程的进化机制，特定环状RNA的进化保守性也是非常有趣的研究方向。

二

环状RNA分子功能研究进展

        环状RNA的分子功能是环状RNA研究的焦点问题。已报道的环状RNA功能模型包括：作为内源性竞争RNA（ceRNA）竞争性结合micro RNA的miRNA海绵（miRNA Sponge）模型；携带内含子的ciRNA和EIciRNA促进基因转录作用的模型；与蛋白相互作用调控其他分子的相互作用；通过影响RNA拼接作用影响RNA拼接的终产物，从而导致RNA终产物因缺少起始密码子而不能正常翻译，作为“mRNA Trap”的模型等。作为一类结构特殊的RNA分子，环状RNA 在生命活动中的分子细胞生物学机制是一个令人着迷的问题。已发现的人类环状RNA的总数量具有惊人的十万多种，不太可能仅用一两个简单的模型可以概括其功能。环状RNA的功能必然对应于本身的序列和结构特征以及由此决定的相互作用分子，细胞和体内定位等基本特征。环状RNA的分子功能是一个与环状RNA分子本身对应的“个性化”的问题，不同的环状RNA分子功能可能完全不同。因此关于环状RNA的分子功能这一基本问题的研究必须基于特定分子。2016年关于环状RNA分子功能的研究有了很多的进步，报道了一系列重要的功能模型，包括找到了一些环状RNA可以编码多肽的线索，调控核糖体的形成过程，调控细胞凋亡过程，调控细胞信号通路等。也有一些传统的环状RNA功能模型的新报道，包括作为miRNA Sponge及存在于外泌体中等。

2.1 环状RNA表达多肽的线索

        最近一两年来关于Non-coding RNA编码多肽的研究论文陆续报道出来了，环状RNA作为一类特殊的非编码RNA，会不会也有编码多肽的能力？这个问题的答案几乎是肯定的，2016年有研究论文和综述针对该问题进行了探索和分析。

        10月11日，Nature出版集团子刊Scientific Reports在线发表了南京医科大学Li Yan团队的一项重要环状RNA研究成果，介绍开发了首个汇总可编码蛋白的环状RNA的数据库：circRNADb(Chen et al., 2016)。（数据库网址：http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb）。文中作者通过汇总整理，共收集了32914条人类外显子环状RNA记录，每条记录都包括基因组位置信息，RNA编辑情况，所对应的基因组序列，IRES序列元件，预测的ORF以及相关的参考文献。作者发现了有16328条环状RNA包含了编码超过100个氨基酸的ORF，其中7170种环状RNA存在IRES序列元件，基本符合翻译蛋白的特征(Chen et al., 2016)。环状RNA中包含有如此丰富的IRES元件是一个非常有意义的发现，这表明环状RNA表达多肽可能不是只存在于极个别分子的现象，而是有一定普遍意义的重要功能。

        7月19日，墨西哥儿童医院的Javier T. Granados-Riveron和Guillermo Aquino-Jarquin在Biochimica et Biophysica Acta杂志撰写了综述论文，讨论了关于环状RNA表达多肽的最新发现和理论推测 (Javier T. et al. 2016)。

        作者汇总了目前已报道的环状RNA可表达多肽的研究报道，包括早在1984年，H. SCHELLEKENS等就曾在Nature上发表文章发现hepatitisδ virus（HDV）病毒中包含着单链环状RNA，并且该环状RNA可以表达一条122个氨基酸的多肽。2014年，Tauqeer Ahmad发表于PNAS的一篇文章证明在水稻中被一种220nt的环状RNA构成的拟病毒感染后会在这种可复制的环状RNA分子上表达出一个16kD大小的蛋白分子，它是在环状RNA分子上从起始密码子反复转圈翻译，直到遇到终止密码子后才结束，因此220nt的分子就编码了16kD的蛋白(AbouHaidar et al., 2014)。与此类似，Jonathan Lytton曾于1999年在JBC杂志发表文章表明发现NCX1基因的2号外显子存在单独环化的环状RNA，该环状RNA大小1799nt，包含了NCX1基因起始密码子上游33nt的序列，由该起始密码子的ORF经过环化后正好在环化位点后面8-10位位置形成了终止密码子。因此作者推测该环状RNA能独立表达600个氨基酸构成的分子量大小约70kD的蛋白(Li and Lytton, 1999)。

图1 目前已知的环状RNA表达多肽的证据（来自(Javier T. et al. 2016)）

        目前在哺乳动物中还没有直接的证据表明环状RNA可以翻译蛋白，但一系列的线索又非常支持这一假设。就在今年召开的环状RNA研究论坛上，暨南大学的张弓教授也在他们翻译组学的分析平台中找出了一些环状RNA表达多肽的线索，相关结果暂未发表。这些线索和相关研究背景非常支持环状RNA会表达多肽的假设。

2.2 外泌体相关环状RNA研究进展

        2015年复旦大学黄胜林教授首次报道发现外泌体中存在环状RNA (Li et al., 2015) ，这一发现为环状RNA研究开辟了全新的方向。总体而言，环状RNA更容易定位于胞质中，外泌体中的环状RNA种类与胞质的有所差别，这意味着环状RNA进入外泌体是一个有选择的过程，具体的机制还不清楚。环状RNA进入外泌体的生理和病理意义也是一个非常重要的科学问题。目前关于外泌体中环状RNA功能的假设有两个：一是外泌体中的物质方便远端细胞间的物质和信息交流，是一种细胞间通讯的途径。二是外泌体中的环状RNA是细胞清除细胞中积累的环状RNA的一种机制。目前关于这两个假设的研究还有待进一步深入。

        2月5日，PLOS One杂志在线发表了科罗拉多大学Erika Lasda教授的研究论文，提出了外泌体及细胞外分泌小泡中的环状RNA为细胞清除內源环状RNA的机制假设。文中作者分析了Hela，293T，U2OS细胞的细胞外分泌小泡（包括外泌体）中环状RNA和线性RNA的相对数量，发现分泌泡中环状RNA相对于线性RNA的比例大大提高。因此作者提出分泌小泡（包括外泌体）是细胞选择性释放內源环状RNA的一种机制。由于分泌小泡会被包括巨噬细胞在内的其他细胞吸收，这些分泌小泡也可能作为细胞间通讯的方式。这一假设比较新颖，但本文的工作还不能完全肯定该假设，会不会有可能是因为分泌小泡中存在核酸外切酶，导致线性RNA减少而表现为环状RNA富集？血小板中富集环状RNA的现象便是由于其中核酸外切酶的作用(Alhasan et al., 2016)，因此本文所发表的数据还不能完全排除这一可能。但外泌体等细胞分泌小泡作为细胞清除环状RNA的机制假设模型还是挺有价值的，值得进一步验证。

        11月28日，美国范德堡大学Zhang Bing团队在Nature子刊 Scientific Reports杂志在线发表了一项环状RNA的研究成果，报道在KRAS突变的结肠癌中环状RNA下调，并且发现这些环状RNA可进入外泌体(Dou et al., 2016)。文中作者用到了三种结肠癌的细胞株：DLD-1，DKO-1和DKs-8。其中DLD-1同时携带了野生型和G13D突变的KRAS，DKO-1只有突变型的KRAS而DKs-8只有野生型。通过RNA-Seq，作者分析了这三种细胞中环状RNA的总体情况，发现相对于DKs-8，另两种细胞中的环状RNA的表达量总体呈现下降状态。作者进一步在另外两种结肠癌细胞系中验证了该结论，HCT116 为KRAS突变的细胞株而HKe3为KRAS不突变的细胞，测序结果表明HCT116的环状RNA表达总体低于HKe3。作者还发现结肠癌相关的环状RNA存在于外泌体中。外泌体中circFAT1明显下调而circRTN4上调最明显，这些基因所对应的线性mRNA变化不明显。这也佐证了环状RNA进入外泌体存在选择性机制。

2.3 环状RNA调控核糖体成熟作用过程

        8月19日，Nature Communications杂志在线发表了德国慕尼黑Ludwig-Maximilians大学Daniel Teupser教授的一项环状RNA研究的重要工作。报道发现动脉粥样硬化相关的一种环状RNA：circANRIL可以调控核糖体RNA的成熟作用(Holdt et al., 2016)。本文揭示了一种全新的环状RNA功能形式：竞争性抑制rRNA加工中间体RNA分子结合到PES1蛋白中，从而影响rRNA的加工成熟，进而影响核糖体生成并导致核仁压力。

2.4 环状RNA调控细胞凋亡 

        11月25日，加拿大多伦多的Sunnybrook研究所健康科学中心的杨伯华教授和他的团队在Nature子刊Cell Death & Differentiation杂志在线发表了一项环状RNA的重要研究成果，报道circ-Foxo3可结合MDM2和p53，促进p53泛素化修饰和降解，稳定Foxo3蛋白，最终导致细胞PUMA上调并增加细胞凋亡敏感性(Du et al., 2016)。

        此外，环状RNA通过竞争性结合miRNA间接影响细胞凋亡通路。9月7日，广州医科大学蒋义国教授在Archives of Toxicology杂志发表论文，发现非编码RNA lncRpa和环状RNA circRar1通过竞争性结合miR-671上调Caspase-8和p38，在铅诱导的神经细胞凋亡过程中发挥重要作用(Nan et al., 2016)。

2.5 环状RNA调控细胞信号通路

        环状RNA作为一大类特殊的RNA分子，它们在细胞中的作用机制绝大部分还是未知，直接或间接参与调控细胞信号通路也是一个重要的探索方向。2016年陆续有多篇文章报道了环状RNA调控细胞信号通路，具体汇总如下（以发表时间为序）：

表1  2016年环状RNA参与调控信号通路的研究报道汇总

2.6 环状RNA作为miRNA Sponge模型的报道汇总
        竞争性结合miRNA作为miRNA Sponge是环状RNA最经典的功能模型，2016年也有一系列的文章分析到环状RNA作为miRNA Sponge的情况，具体汇总如下（以发表时间为序）：

表2  2016年环状RNA参作为miRNA Sponge的研究报道汇总

        miRNA Sponge虽然是最经典的环状RNA功能模型，但是否具有普遍性和代表性却受到了国内外许多专家学者的怀疑。首先要对内源性miRNA形成有效的竞争能力必须要有足够的浓度和正确的定位，但从已发表的结果来看，环状RNA在细胞内的丰度普遍较低，很难对miRNA形成有效的竞争结合作用。其次，所分析的环状RNA结合对应的miRNA的结合位点数偏少，也大大降低了环状RNA有效竞争结合miRNA的可能性。7月3日，Briefings in Bioinformatics杂志发表了德国歌德大学Shizuka Uchida与同事的一项研究工作，介绍基于信息学分析和实验验证lncRNA和circRNA作为miRNA Sponge。作者验证实验中证实了已报道的lncRNA作为miRNA的内源性竞争RNA分子可以通过实验验证出来，比如LINC00324通过结合 miR-615-5p 抑制 BTG2，LOC400043通过结合miR-28-3p 和miR-96-5p影响多个信号通路。作者也进行了circRNA作为miRNA Sponge的验证，但他们所得出的结论却是阴性的，作者得出结论绝大部分环状RNA并不具备miRNA Sponge的功能。

三

环状RNA与疾病或生理活动相关性研究进展

        环状RNA的疾病和生理学意义是环状RNA研究的核心问题之一，对未来开发基于环状RNA的分子诊断方法或疾病治疗方法都具有重大意义。随着以二代测序技术为代表的新一代分子检测技术的兴起，疾病或生理活动相关的环状RNA的筛选鉴定一直持续进行中。

3.1 环状RNA与生殖发育
        6月17日，北京大学生物动态光学成像中心的黄岩谊，汤富酬和北京大学第三附属医院乔杰合作完成了一项重要的circRNA研究成果：在人类着床前胚胎中系统分析不含PolyA的RNA表达情况，其中发现了大量的circRNA。相关工作发表于Genome Biology杂志上(Dang et al., 2016)。本文的首次系统分析了人类胚胎着床前不同阶段环状RNA的表达情况，在之前报道的PolyA+ RNA研究的基础上，丰富了PolyA— RNA在人类胚胎发育过程中的认识。为增进人类胚胎发育机制的认识以及circRNA参与调控的复杂机制相关的研究提供了宝贵的资源。

        12月13日，Scientific Reports在线发表了华中科技大学同济医学院李红刚为通讯作者的文章，介绍在人类静夜中发现大量环状RNA(Dong et al., 2016c)。作者共鉴定到一万五千多种环状RNA，其中大部分为首次发现和报道的，这些新发现的环状RNA对应的基因主要参与精子发生，精子运动和受精作用。这项工作开辟了新的环状RNA研究方向，也为无创诊断提供了新的探索方向。8月25日，RNA Biology杂志在线发表了中科院动物研究所韩春生教授为通讯作者的研究论文，介绍他们系统分析睾丸组织中转录组学的研究成果，其中讨论了环状RNA的表达情况(Lin et al., 2016b)。作者也分析了小鼠睾丸组织中环状RNA的表达情况。

        5月19日，PLOS One杂志发表了日本立命馆大学Chieko Koike教授为通讯作者的文章，介绍发现小鼠视网膜发育过程及成年后的视网膜中QKI蛋白的变化情况(Suiko et al., 2016)。文章没有直接对视网膜中环状RNA的表达情况进行研究分析，但由于QKI是重要的环状RNA形成相关的调控蛋白，该发现也预示着视网膜组织中环状RNA可能有变化。

3.2 环状RNA与神经系统
        神经系统是目前已知的环状RNA丰度最高的组织，环状RNA在神经系统的生理和病理过程中发挥什么作用是一个重要的基本科学问题。2016年神经系统中环状RNA的发表论文中综述性文章明显增多。

        研究论文方面，2月2日，广州医科大学第二附属医院Lin Shao-peng及其团队在BBRC杂志发表论文，介绍发现脑缺血再灌注损伤中环状RNA变化情况，以oxygeneglucose deprivation/reoxygenation (OGD/R)为模型，在HT22细胞中发现环状RNA变化(Lin et al., 2016a)。7月12日，Biomarkers in Medicine杂志发表了解放军一〇二医院张理义教授的研究论文，发现环状RNA hsa_circRNA_103636与抑郁症的关系(Cui et al., 2016)。作者利用环状RNA芯片针对30例抑郁症患者4周和8周后抗抑郁药物治疗后环状RNA表达变化情况进行分析，最终筛选到4个变化特征较明显的环状RNA分子，但只有hsa_circRNA_103636在8周治疗中表现为明显下降。因此作者认为外周血检测hsa_circRNA_103636表达可以作为候选的抑郁症标志物。7月29日，Journal of Neurochemstry在线发表了新南威尔士大学Michael Janitz教授的最新研究论文，探索了环状RNA在大脑多系统萎缩症（multiple system atrophy，MSA）中的作用(Bei Jun Chen et al. 2016）。作者发现了五种MSA相关的环状RNA：IQCK、MAP4K3、EFCAB11、DTNA 和MCTP1。这五种环状RNA在MSA病人的额叶皮层白质中特异性高表达，但它们所对应的线性RNA表达变化不明显。

综述性文章有代表性的包括：
        8月26日，Frontiers in Molecular Neuroscience杂志在线发表了荷兰University Medical Center Utrecht的R. Jeroen Pasterkamp教授为通讯作者的综述文章，讨论了环状RNA在神经发育中的作用机制的相关研究进展情况（Daniëlle et al., 2016）。

        文中作者共总结了11种环状RNA可能参与调控神经发育过程的机制模型：（1）竞争性结合micro RNA，例如CDR1as，SRY等环状RNA；（2）影响轴突生长和神经元迁移，例如体外过表达CDR1as会影响神经元迁移作用；（3）miR-671 可结合CDR1as并诱导AGO介导的降解CDR1as作用，释放所结合的micro RNAs；（4）通过RNA结合蛋白影响环状RNA的形成及竞争性结合RBP的作用，例如QKI，MBL或ADAR1调控的环状RNA形成过程，环状RNA竞争性结合TDP-43的作用等；（5）通过结合RBP促进后者的细胞定位变化，比如在神经突触中的定位；（6）环状RNA作为RBP蛋白形成复合物的脚手架，促进RBP的相互作用和形成更复杂的蛋白-RNA复合物；（7）EIciRNAs通过结合RNA聚合酶II促进所对应的基因的转录作用；（8）环状RNA直接表达多肽；（9）特定的环状RNA表达受到神经元状态的影响；（10）环状RNA定位于突触小泡结构中；（11）环状RNA定位于胞外膜结构中，可能参与远距离相互作用机制。以上总结的这些机制模型涵盖了绝大部分环状RNA研究的机制模型，它们均可能是环状RNA在神经系统中发挥作用的方式。

最后作者还总结了目前探讨环状RNA在神经发育过程中作用机制相关的八个重要科学问题：
（1）神经系统的环状RNA起什么作用？
（2）miRNA sponge或结合RNA结合蛋白是环状RNA发挥作用的主要方式吗？
（3）调控神经特异性环状RNA形成的顺式作用元件和反式作用因子是什么？
（4）神经特异性环状RNA神经活性相关性表达及时空表达规律是什么？
（5）神经中环状RNA转运和分泌的方式是什么？
（6）神经特异性环状RNA的序列和功能在进化上的保守性如何？
（7）神经特异性环状RNA是否影响神经系统的发育和病变过程？
（8）环状RNA能作为神经系统的标志物以及治疗靶点或工具吗？

        7月18日，Cell子刊 Trends in Neurosciences 在线发表了南方科技大学陈炜教授与马普学会Erin Schuman联合撰写的综述文章，分析汇总了环状RNA在大脑组织中表达状态的研究进展。神经系统，尤其是中枢神经系统中环状RNA研究比较多，从目前报道的结果来看似乎神经系统中环状RNA的含量相对更丰富一些。本文作者正是针对这一特殊现象针对目前在神经系统中环状RNA的主要进展进行分析汇总(Chen and Schuman, 2016)。有几大特征暗示环状RNA在神经系统中扮演着非常特殊的角色：1. 大部分环状RNA的表达丰度较低，但一些环状RNA的表达丰度较高，甚至超过了所对应的线性RNA的表达量。2. 环状RNA的表达特征呈现细胞类型和发与分化状态特异性的特征。虽然这些环状RNA所对应的线性RNA在不同类型的细胞中均有表达，但所对应的环状RNA表达谱特征有非常明显的差别。3. 有些环状RNA分子有高度保守的特征，甚至可以追溯到果蝇中都有同源性较高的环状RNA存在。这些特征暗示了环状RNA很可能存在目前尚未揭晓的重要功能。

3.3 环状RNA 与血液和循环系统
        2016年血液和循环系统中环状RNA的研究亮点较多，包括发现了心肌中特定环状RNA的形成机制，经典的染色体易位形成的类癌基因作用的环状RNA，血小板中环状RNA富集，环状RNA与心肌梗死，系统性红斑狼疮等疾病的关系等等。

        8月16日，循环学顶级杂志Circulation Research杂志在线发表了一项重要的环状RNA研究最新成果，该论文的通讯作者是荷兰阿姆斯特丹VU大学医学中心的Esther E. Creemers教授和Yigal M. Pinto教授。本文介绍发现了扩张型心肌病重要的致病基因RBM20参与调控了Titin基因一类特殊环状RNA形成的过程(Khan et al., 2016)。这项研究为揭示特定环状RNA的形成机制提供了很好的借鉴。

        4月7日，Cell杂志在线发表了哈佛大学医学院Pier Paolo Pandolfi教授的研究论文，介绍发现急性早幼粒细胞白血病（APL）经典的染色体易位t(15:17)形成的融合基因不仅可表达融合蛋白PML/RARα，还可以形成全新的环状RNA，作者将其命名为F-circRNAs。文章中介绍发现F-circRNAs可促进细胞增殖，抵抗药物等处理条件诱导的凋亡，小鼠模型中还可以促进肿瘤的生长。这些结果表明F-circRNAs也具有类癌基因的作用(Guarnerio et al., 2016)。该研究表明APL的疾病发生过程或许也有基因融合形成的环状RNA的贡献。

        3月3日，Blood杂志正式发表了纽卡斯尔大学Michael S. Jackson教授一项研究成果，介绍证明血小板中大量富集环状RNA，可能是由于线性RNA和环状RNA在血小板中的降解速度差异导致的。作者还发现红细胞中也存在环状RNA富集的情形(Alhasan et al., 2016)。

        8月19日，Nature Communications杂志在线发表了德国慕尼黑Ludwig-Maximilians大学Daniel Teupser教授的一项环状RNA研究的重要工作。报道发现动脉粥样硬化相关的一种环状RNA：circANRIL可以调控核糖体RNA的成熟作用(Holdt et al., 2016)。9月13日，J Am Coll Cardiol.以Letters形式在线发表了卢森堡心血管研究部研究院的Yvan Devaux博士一项研究成果，他们研究发现了一种心肌梗死特征性的环状RNA：MICRA，从外周血中检测该环状RNA可以预测左心室的功能(Vausort M, et al. 2016)。9月1日，青岛大学医学院李培峰教授和王昆教授在European Heart Journal发表文章介绍发现一种心脏相关的环状RNA（HRCR）通过竞争性结合miR-223提高ARC含量，在心脏病理性肥大中保护心脏的功能(Wang et al., 2016)。
        2016年也有多篇综述文章汇总分析了血液和循环系统中环状RNA的研究进展。

        7月26日，Journal of Molecular and Cellular Cardiology杂志在线发表了德国慕尼黑工业大学Stefan Engelhardt教授的文章，分析了人，小鼠和大鼠不同发育阶段或生理病理状态下环状RNA表达与定位变化情况，结果表明环状RNA与心脏发育，生理和病理过程有非常密切的关系(Werfel et al., 2016)。在各个物种所选择的组别中分析环状RNA的分布情况，发现了几个高特异性变化的环状RNA分子。大鼠中发现了Slc8a1、Ttn、Eya3、Scmh1等基因对应的环状RNA，小鼠及人类的组织中Slc8a1和Ttn基因对应的环状RNA在心脏中表达特征非常奇特。这些基因均可作为分析环状RNA与心脏生理病理过程机制相关性研究的理想候选基因。此外，在人的心脏组织中发现了一个特殊的基因：ryanodine receptor 2 (RYR2)，在心脏中该基因对应的环状RNA超过100种，这比较罕见。
 
        7月21日，安徽医科大学叶冬青教授在Experimental Cell Research发表综述，讨论了环状RNA与系统性红斑狼疮的关系(Li et al., 2016)。文中叶教授认为作为miRA Sponge的环状RNA或许与系统性红斑狼疮的发病过程存在密切联系，但目前尚缺乏直接证据。

3.4 环状RNA与衰老
        环状RNA衰伴随老过程积累是非常有趣的问题，是伴随现象还是重要的衰老信号机制还没有完全解释清楚。
        

        12月13日，Scientific Reports在线发表了内华达大学Pedro Miura教授团队的一项研究成果，介绍发现环状RNA在老龄化的小鼠大脑中富集，而所对应的心脏中没有发现明显的富集效应，这些环状RNA所对应的线性RNA分子变化也不明显，说明环状RNA的富集行为是不依赖所对应的线性RNA的(Gruner et al., 2016)。

        2月11日，加拿大多伦多的Sunnybrook研究所健康科学中心的杨伯华教授团队在European Heart Journal在线发表文章，介绍circ-FOXO3与心肌衰老有关。作者发现circ-FOXO3在衰老的人和小鼠心肌组织中高表达。circ-FOXO3定位于细胞质中，通过与ID-1，E2F1，FAK和HIF1α调控细胞衰老进程。过表达circ-FOXO3会促进衰老进程，干扰后抑制衰老进程。

        12月7日，Nucleic Acids Research杂志在线发表了NIH遗传与基因组学实验室Amaresh C. Panda和Ioannis Grammatikakis为通讯作者的文章，介绍发现circ-PVT1具有抗衰老的作用。文中通过分析培养代数早的和晚的细胞中环状RNA的变化情况，发现circ-PVT1在衰老的细胞中明显下降。基于预测和实验验证，作者证实circ-PVT1可以竞争性结合let-7，抑制let-7调控的下游基因，包括IGF2BP1, KRAS和HMGA2最终抑制衰老进程。  

3.6 组织特异性环状RNA研究进展
        8月20日，武汉大学基础医学院何春江教授团队在著名生物信息学杂志Briefings in Bioinformatics发表了一项环状RNA的重要工作，系统分析了人类和小鼠组织特异性环状RNA的表达情况(Xia et al., 2016)。  

3.7 肿瘤及其他疾病中特征性环状RNA筛选鉴定 
        2016年在以肿瘤为代表的人类疾病中特征性环状RNA的鉴定分析类型的研究报道依然是主角，一年以来发表了众多的相关研究论文。汇总如下表（以发表时间为序）：

表3  2016年疾病特异性环状RNA鉴定分析研究报道汇总

3.8 热休克反应中环状RNA变化 
        10月31日，Molecules杂志在线发表了哥本哈根大学Henrik Nielsen教授和斯特拉斯堡大学Benoit Masquida教授作为共同通讯作者的研究论文，发现热休克反应中I类内含子来源的环状RNA积累的现象(Andersen et al., 2016)。粘霉菌Didymium iridis中I类内含子会伴随着Heat-shock条件而明显增高，这可能与内含子的移动性有关。

3.9 环状RNA作为疾病诊断标志物的可行性论证
        2月5日，BJOG杂志在线发表了广州妇幼保健中心Yang Hong-ling为通讯作者的文章，介绍血液环状RNA结合血浆蛋白检查可用于先兆性子痫的诊断。该研究共收集分析了1400例孕妇的标本，其中41例患有先兆性子痫，最终作者得出结论血浆蛋白endoglin结合环状RNA circ_101222可提高先兆性子痫的诊断效率。无独有偶，7月19日Cellular Physiology and Biochemistry杂志在线发表了南京医科大学Manhong Cai和Ruizhe Jia为通讯作者的文章，表明先兆性子痫患者的胎盘组织中环状RNA呈现富集状态。这些报道都暗示环状RNA在先兆性子痫疾病诊断中有重要价值。

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