环状RNA分子circHIPK3结合多种miRNA进而调控细胞生长

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声 明

        拥有闭合环形特殊结构的circRNA分子受到越来越多的科学家的关注，今天给大家介绍一篇非常经典的circRNA文献，来自复旦大学黄胜林及何祥火教授为共同通讯作者发表Nature Communications杂志上。文章介绍了环状RNA分子circHIPK3能够像海绵一样结合多种miRNA进而调控细胞生长。 

本文思路与结论

        环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，也是RNA领域最新的研究热点。与传统的线性RNA不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。有报道称circRNA可以作为miRNA海绵调节基因表达，但是只有少量的circRNA能够结合某一种特殊的miRNA，关于circRNA的功能研究也很缺乏，本文正是围绕这一问题开展的。作者对六种正常组织及七种癌症组织进行RNA测序得到了27000多个候选circRNA分子，然后从这些候选分子中筛选了来自HIPK3基因Exon2的circHIPK3进行深入研究，结果发现抑制circHIPK3而不是HIPK3 mRNA能够显著抑制人类细胞增殖，通过luciferase筛选实验发现circHIPK3能够结合9种miRNA并且找到18个潜在结合位点。另外，作者还发现circHIPK3能直接结合miR-124并抑制miR-124的活性。最终证明由前体mRNA生成的环状RNA在人类细胞中发挥了重要的调控作用。

        人类正常组织及癌组织circRNA测序。通过对六种正常组织及七种癌症组织进行RNA测序得到了27000多个候选circRNA分子并对它们进行了统计分析。

图1人类正常组织及癌组织circRNA分析（来自[1]）

        接下来，主角登场，通过统计分析发现，来自HIPK3基因Exon2的circHIPK3有很高的丰度并且back-spliced率也很高（图中蓝点）。

图2 circRNA丰度分析（来自[1]）

        除了circHIPK3外还有四个异构体分别命名为circHIPK3.2， circHIPK3.3，circHIPK3.4和circHIPK3.5，其中circHIPK3是最主要的异构体。另外，除肝组织外，在脑肺心胃结肠组织中circHIPK3表达丰度很高。并且circHIPK3很稳定半衰期超过24h，经RNaseR处理后circHIPK3表现一定的抵抗性，对细胞不同组分进行PCR分析及FISH实验发现circHIPK3主要存在于细胞质中。

图3 circHIPK3特性分析（来自[1]）

        接下来，作者探讨了circHIPK3的形成机制。通过序列分析发现HIPK3 Exon2含有高度互补的Alu重复序列，于是作者克隆了Exon2上游1039nt到Exon3下游988nt到pcDNA3上，将该片段两端的Alu序列分别或全部删掉发现没有circHIPK3形成，说明这两个Alu序列对circHIPK3形成至关重要。接着作者运用CRISPR/Cas9技术将细胞内的重复序列敲除，发现将下游的Alu序列敲除后circHIPK3环化受到抑制，而将上游的Alu序列敲除后circHIPK3环化效率升高，作者的解释是上游有很多Alu序列可能是其他的Alu序列影响circHIPK3环化，进一步研究证实了该猜测。

图4 circHIPK3来自于HIPK3 Exon2（来自[1]）

        
        接下来作者分别设计了针对circHIPK3、HIPK3 mRNA的siRNA序列，经细胞增殖实验和EdU结合实验表明，敲降了circHIPK3而不是HIPK3 mRNA抑制了细胞增殖。

图5 沉默circHIPK3 RNA抑制细胞增殖（来自[1]）

        经CLIP、RIP及pull down等实验证实circHIPK3可以与AGO2结合，进而间接证明circHIPK3可以与miRNA结合。通过荧光素酶报告基因实验进一步证实circHIPK3可以与AGO2及miRNA结合。接着进行miRNA文库筛选，发现9种miRNA（miR-124，miR-152，miR-193a，miR-29a， miR-29b，miR-338，miR-379，miR-584和miR-654）能够与circHIPK3结合，然后用TargetScan和PicTar对这些miRNA的结合位点进行了预测并用序列突变实验进行了验证，研究证实circHIPK3可以充当这些miRNA的海绵作用。

图6 circHIPK3像海绵一样结合多种miRNA（来自[1]）

        接着作者检测了上述miRNA对细胞增殖的抑制作用发现，miR-124对细胞增殖的抑制作用最为显著。另外，作者还发现circHIPK3可以结合miR-124，并且与miR-124一样都分布在细胞质中。通过功能恢复实验证实circHIPK3能够抑制miR-124活性。

图7 circHIPK3结合miR-124并抑制miR-124活性（来自[1]）

        这篇文章的思路非常清晰，先是从正常组织和癌组织标本中测序得到候选circRNA分子，然后选取丰度较高的circHIPK3进行深入研究，结果发现抑制circHIPK3而不是HIPK3 mRNA能够显著抑制细胞增殖，接着通过luciferase筛选实验发现circHIPK3结合9种miRNA。选取这9种miRNA中对细胞抑制作用最明显的miR-124进一步研究，发现circHIPK3能直接结合miR-124并抑制miR-124的活性。最终证明由前体mRNA生成的环状RNA在人类细胞中发挥了重要的调控作用。

参考文献：

1. Zheng, Q., et al., Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016. 7(11215).

circRNA

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