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昨天湖人为大家支了五招，讲怎么构建circRNA过表达载体，今天就接着介绍怎么严谨地验证是否过表达成功。
构建好载体之后，自然是验证能否成功（正确）过表达了，常用的思路是瞬时转染细胞系，24-48h后取样做RT-qPCR检测，以2-△△Ct法计算表达差异。而对于circRNA过表达来讲，因为其准确成环难度大，转录后还要经过剪切环化，仅仅做常规的RT-qPCR计算表达差异是不够的，而是一定要将PCR的产物进行电泳，检测是否单一条带，条带大小是否正确，并且进行sanger测序，比对PCR产物的序列是否和基因一致，确保环化位点处准确成环，没有错误添加进酶切位点或缺失序列。
此处还有一个难点，circRNA由于其反向剪切后环化位点（Splice Junction）在基因组上mapping是前后相反的，所以检测circRNA的特异引物一般设计为Divergent primers，这和用来检测线性基因的Convergent primers相对应。多数文章里描述Divergent primers是相反方向设计，上下游引物分别在环化位点的两端，使扩增产物内包含环化位点。但这样设计的引物具体位置和扩增特异性问题大都语焉不详，相信很多同学也发现这样设计引物总是有非特异条带或者扩增无条带的情况，稀里糊涂的做就不可取了。这里的重点就是，针对检测circRNA过表达，需要同时设计两种Divergent primers，产物要经电泳确认大小，并且进行sanger测序。
首先来看一下引物设计，第一种普通的Divergent primers可参考大部分文章（如：circRNA引物设计），一般设计成背对背，使环化位点包含在产物中间，除了需要将序列首尾拼凑成环化后的形式外，和普通的引物设计基本一样的思路。设计出来大概是这样的：
对应在外显子上是这样的，此时扩增产物是绿色框选部分，中间包含一个环化位点（红色标记）。
这种引物设计思路没有问题，但如果是下图的情况呢？
上面的情况是最常见的，因为circRNA的反向剪切有高度的可变性，可能是exon4单独成环，可能是exon4/5成环，也可能是exon3/4/5或者exon2/3/4/5/6成环，包含exon4的circRNA有多个，此时按上面的方法对has_circ_0079274设计引物，预期扩增红色框选部分，但实际上引物可以同时扩增到exon4/5、exon3/4/5或者exon2/3/4/5/6等成环产物（绿色框选），那么引物的特异性就没办法保证了，PCR产物电泳检测很可能是多条带，所以就需要第二种引物了。
第二种引物我自己叫做跨环化位点的引物（Splice Junction Overlapping Divergent Primers，Sjod Primers)，主要基于两点考虑：
1）不同circRNA的环化位点处序列肯定是不一样的；2）引物的3’端容错率低，有错配会直接影响扩增效率。Sjod Primers设计需要将环化位点放在一条引物的3’端，以使环化位点包含在引物上，而不是包含在PCR产物中，PCR时这条引物只有匹配目的circRNA才能正常扩增，而有错配时基本不能扩增，以此大大提高特异性。Sjod Primers设计出来大概是这样的：
实际设计时可根据具体序列将环化位点放在上游或下游引物的3’端皆可，另一条引物按一般方法设计，确保两条引物是背对背方向即可。Sjod Primers的3’端跨越环化位点几个碱基是一个关键的因素，一般设计跨越3-8个碱基效果最好，跨越碱基过少，可能PCR时被忽略错配差异，无法精确匹配环化位点；跨越碱基过多特别是超过10nt时，可能只由3’端部分序列主导PCR过程，此时引物的5’端相当于悬挂接头，不在PCR过程中匹配模板，最终扩增产物大部分是线性基因的序列，会导致假阳性结果。
再回去看看刚才的图，如果分别对exon4、exon3/4/5或exon2/3/4/5/6的成环产物设计Sjod Primers，即使基因有部分序列相同，也可保证每个circRNA的引物都不同，确保特异性。
以上两种引物设计好后也应先用样品扩增验证一下，并最好对PCR产物进行sanger测序，以确认扩增产物是正确的。
接下来检测circRNA过表达是否成功，需要同时用到普通的Divergent Primers和Sjod Primers两对引物，其中：1）普通的Divergent Primers扩增产物在过表达组样品中应该是单一条带且大小正确，在NC中可能不是单一条带；2）Sjod Primers扩增产物在过表达样品和NC组都应该是单一条带且大小正确。具体步骤如下：
1. 同时用普通的Divergent Primers和Sjod Primers进行RT-qPCR，扩增曲线要正常，熔解曲线是单一峰，数据计算有过表达，一般50倍以上就是比较好的结果。无条件的也可以做半定量。
2. 分别对Divergent Primers和Sjod Primers的PCR产物做电泳检测，确认产物是单一条带，并且大小正确。
3. 过表达组样品使用Sjod Primers扩增的PCR产物进行sanger测序，以确认环化位点处是正确的。此时若有环化错误，在测序结果中是可以发现的。
先来看一个成功过表达的，使用Sjod Primers扩增条带单一且大小正确，使用普通Divergent Primers扩增条带同样单一且大小正确，PCR产物后经sanger测序确认环化位点处序列完全正确，电泳图也显示两对引物扩增产物都有过表达。
下面是一个错误环化的例子，使用Sjod Primers扩增条带单一且大小正确，但观察不到明显的过表达。使用普通Divergent Primers扩增条带显示NC样品中约250bp大小正确，但OE样品中条带明显偏大，后经sanger测序确认OE中将载体上含酶切位点的一段序列错误环化进去了。
综合来讲，和检测其他线性基因过表达不同，对circRNA的过表达检测必须同时使用普通的Divergent Primers和Sjod Primers两对引物。普通的Divergent Primers特异性较差，但可以扩增到环化错误的条带（若有），适合扩增条带来做sanger测序。而Sjod Primers特异性高，适合做定量检测。另外扩增产物必须进行sanger测序，以确认过表达后产物是准确环化的，当然sanger测序得到环化位点处序列也是目前验证circRNA真实存在的金标准，这个测序结果自然是重中之重了。
好了，昨天湖人为大家支了五招来构建circRNA过表达载体，今天再介绍了相对严谨地验证是否过表达成功，相信对大家有所启发