荐读 | circFAT1与恶性骨肉瘤发生相关

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声 明

骨肉瘤（OS）是一种常见的恶性骨癌，发生在青春期和儿童期的概率最高。在临床上，即使已经有多种治疗方法，包括手术、化疗等，但是患者的5年生存率依然小于70％。主要的原因是由于肿瘤复发而引起的转移和耐药性。此外，有效的OS治疗靶点或诊断标志物尚未确定，因此难以改善患者的预后。因此，制定更好的战略和发挥在那新的治疗方法，以避免抵抗和远处转移，才可以进一步改善OS患者的预后。

最近来自浙江大学医学院邵逸夫医院骨科的研究人员于Molecular Cancer（IF= 7.776）上在线发表了题为CircFAT1 sponges miR-375 to promote the expression of Yes-associated protein 1 in osteosarcoma cells的研究，介绍了FAT1基因的2号外显子形成的circFAT1在人骨肉瘤（OS）组织表达上调的现象。机制上，circFAT1可以海绵miR-375，上调YAP1基因表达，从而促进骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭。该研究证明了circFAT1在骨肉瘤中的致瘤性，可能有望成为骨肉瘤治疗的靶点。

为了研究circFAT1对OS形成的影响，作者首先检测了circFAT1在OS组织和细胞系中的表达情况。RT-qPCR和CISH实验显示了在OS组织和细胞系中circFAT1的表达水平明显上调。Sanger测序证明了circFAT1其实是FAT1基因的2号外显子首尾拼接的产物。相比于FAT1 mRNA，circFAT1更耐受RNase R的消化。RT-PCR和northern blot实验证明了在HOS 和143B细胞系的确存在这种circFAT1。FISH实验表明circFAT1主要定位于胞浆。

下一步，作者将研究circFAT1对OS细胞生长的影响。CCK-8实验证明了在143B和HOS两种骨肉瘤细胞中，敲低circFAT1表达可以明显抑制细胞的增殖能力；FACS和WB实验证明了敲低circFAT1表达促进OS细胞的凋亡，促进了剪切型的caspase3 和PARP蛋白表达。克隆形成实验、迁移和侵袭实验、划痕实验则证明了敲低circFAT1表达明显抑制了OS细胞的迁移和侵袭能力。

circFAT1表达水平明显对于OS细胞的迁移和侵袭能力如此重要，那么其中的机制到底是什么？已被大量报道的circRNA功能主要是circRNA作为miRNA的海绵，调控其下游基因的表达。通过对doRiNA数据库中AGO2免疫沉淀的高通量数据进行分析，发现AGO2与circFAT1存在很高水平的结合，而且该结合区域序列在多种脊椎动物中是属于高度保守的。体外利用AGO2抗体进行的免疫沉淀RNA，也发现了内源性circFAT1的存在。通过对三个数据库miRanda, Targetscan和RNAhybrid交叉预测了circFAT1可能结合的16种miRNA。利用biotin标记的circFAT1探针进行pull-down实验，证明了在两种OS细胞中，只有5种miRNA才可以结合circFAT1；luciferase reporter实验进一步证明了miR-375明显抑制含有circFAT1 3′-UTR的报告质粒的荧光素酶的活性，可能主要是因为circFAT1 包含miR-375的8mer-1a结合位点。RNA FISH实验则证明了circFAT1与miR-375在胞浆中的共定位。

上一步的结果表明circFAT1 很有可能结合miR-375，那么miR-375在OS组织和细胞中的表达情况是怎样的？RT-qPCR和FISH实验显示了在OS组织和细胞系中miR-375的表达水平明显下调。过表达miR-375明显抑制OS细胞的增殖，而促进细胞的克隆形成能力、迁移和侵袭能力。抑制miR-375表达则减少细胞的凋亡，反向说明miR-375可以促进细胞的凋亡。

miR-375与YAP1的关系：为了评估miR-375在OS中发挥的功能，作者通过PicTar和TargetScan预测了miR-375很有可能与YAP1 mRNA的3′-UTR存在结合位点；相比于软骨瘤，骨肉瘤中YAP1的表达水平明显上调；IHC结果说明了在骨肉瘤组织中，YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表达明显上调；luciferase reporter实验证明miR-375可抑制含有YAP1 3′-UTR质粒的荧光素酶活性，提示miR-375可以特异性靶向结合YAP1 3′-UTR；WB、RT-qPCR和FISH实验证明了抑制miR-375表达明显上调YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表达，而miR-375过表达明显抑制YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表达。重要的是，过表达YAP1明显抑制OS细胞的凋亡。

miR-375与YAP1的功能联系：接着作者猜测miR-375通过抑制YAP1表达，发挥抑制肿瘤形成的能力。FISH实验、流式检测凋亡实验、克隆形成实验、CCK-8检测增殖实验、划痕实验、迁移和侵袭实验证明了miR-375过表达可明显抑制YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表达，抑制细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力，而当同时过表达YAP1则会逆转这些抑制效应。给予miR-375 sponge抑制miR-375功能后明显减少细胞的凋亡，而同时抑制YAP1表达则促进细胞的凋亡。

miR-375与circFAT1的功能联系： 和上一步结果的实验相似，证明了敲低circFAT1表达明显抑制了YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的蛋白和mRNA表达，抑制细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力，而当同时敲低miR-375表达则会逆转这些抑制效应。circFAT1过表达明显减少细胞的凋亡，而同时过表达miR-375则促进细胞的凋亡；

circFAT1/miR-375/YAP1轴对于体内OS细胞成瘤的影响：构建的circFAT1敲除和/或miR-375 敲低的OS细胞在裸鼠成瘤后，发现敲除circFAT1明显抑制体内的成瘤，减少了瘤子体积，降低了瘤组织中YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表达；而同时敲低miR-375表达则会促进细胞的体内成瘤，增加瘤子体积，上调YAP1和其靶基因c-Myc、Birc5的表达水平。

参考文献

1. Liu G, et al. CircFAT1 sponges miR-375 to promote the expression of Yes-associated protein 1 in osteosarcoma cells. Mol Cancer. 2018 Dec 4;17(1):170. doi: 10.1186/s12943-018-0917-7.

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