Nature Communications | 猕猴大脑衰老circRNA研究

2020年7月17日，中科院昆明动物所的李家立教授在Nature Communications（IF=12.121）杂志上发表了一篇题为“CircGRIA1 shows an age-related increase in male macaque brain and regulates synaptic plasticity and synaptogenesis”的文章，阐述一种circRNA(circGRIA1)在猕猴大脑中显示出年龄和性别依赖性的表达模式，它可以通过竞争性结合其亲本基因（Gria1）启动子，来负向调节Gria1表达。功能上，circGRIA1可以调节年龄相关的钙稳态失衡、突触形成减少和突触可塑性缺陷，这为探索衰老相关神经疾病的机理和干预措施提供了重要参考（[1]）。

环状RNA(circRNA)在哺乳动物大脑中含量丰富，有些circRNA显示出年龄依赖性的表达模式。本篇文章中，作者报道一种保守的circRNA—circGRIA1，它是兴奋性氨基酸受体-AMPA受体亚基Gria1基因衍生的circRNA亚型，circGRIA1主要位于细胞核，在猕猴前额叶皮层和海马中表现出与年龄相关的表达增加。circGRIA1与Gria1基因的启动子区域存在关联，并可以负向调节Gria1 表达。敲低circGRIA1可显著地改善老年雄性猕猴海马神经元的突触再生及GluR1依赖的突触可塑性。该发现强调了circRNA调控的重要性，并提供了对大脑衰老生物学的新见解。

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猕猴大脑中circGRIA1显示出年龄和性别依赖性的表达模式

在此之前，作者使用深度RNA图谱，绘制过猕猴大脑衰老过程中circRNA表达变化的综合图谱。为了探讨circRNA及其亲本mRNA表达与年龄之间的变量关系，作者选出11种表达与衰老相关的circRNA作为候选分子。在本项研究中，作者选取了其中一种circRNA—circGRIA做进一步分析。作者发现总共有12种来自Gria1基因座的circRNA亚型，包括2个单外显子、9个多外显子和1个内含子circRNA。其中，circGRIA1是由Gria1基因外显子4、5、6形成的进化保守亚型，在20岁雄性猕猴样本中高表达。重要的是，circGRIA1与其亲本mRNA（Gria1）的表达呈负相关。

接下来，作者从冷冻的10岁和20岁雄性猕猴脑样本中提取RNA，进行qPCR来检测circGRIA1和Gria1 mRNA的表达水平，验证了circGRIA1与Gria1 mRNA表达的负相关，且发现比较于10岁雄性猕猴，circGRIA1在20岁雄性猕猴的前额叶皮层（PFC）、OC、海马CA1和齿状回（DG）中表达上调。随后，作者使用针对环化位点的探针（专门识别Gria1环状转录物）和来自外显子的探针（可识别Gria1线性和环状转录物）进行Northern blot，来进一步验证10岁和20岁雄性猕猴海马中circGRIA1的表达差异，结果与上述一致，circGRIA1表达在20岁雄性猕猴海马中显著上调。令人惊讶的是，circGRIA1表达在10岁和20岁雌性猕猴中并无差异，且表达较低。以上实验结果表明，在雄性猕猴大脑中circGRIA1显示出衰老相关的表达模式。将RT-PCR产物的Sanger测序结果与Gria1基因组进行比对，进一步证实circGRIA1来源于Gria1基因组。由于circGRIA1的亚细胞分布可以决定其功能。因此，作者通过RT-qPCR分析了20岁雄性猕猴海马组织中胞质和胞核内circGRIA1的表达水平。结果表明，circGRIA1主要定位于胞核。

图1  circGRIA1和Gria1 mRNA表达的特征

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circGRIA1与Gria1 mRNA的表达呈负相关

接下来，作者决定探索circGRIA1表达是否与大脑衰老的生物学过程相关。首先，作者使用BASEscope原位杂交（ISH），来证实在雄性猕猴的PFC、CA1和DG中circGRIA1表达随年龄增长而上调，Gria1 mRNA表达则随着年龄增长而下调。有趣的是，在20岁雌性猕猴的PFC和海马中，没有检测到circGRIA1表达与年龄相关的增加，但是作者发现了Gria1 mRNA表达与年龄相关的减少。免疫组化（IHC）和western blot结果显示，在20岁雄性、雌性猕猴的PFC和海马中GluR1表达均减少。这表示，在雌性和雄性猕猴大脑内调控Gria1表达和功能的机制有所不同。

接下来，作者调查，在体外培养的胎儿猕猴海马神经元中，circGRIA1表达是否也显示年龄的依赖性。作者使用BASEscope ISH和RT-qPCR检测了体外培养14天（DIV14）和DIV28的雄性胎儿猕猴海马神经元中circGRIA1的表达水平，结果与体内实验相一致，DIV28神经元中circGRIA1表达水平高于DIV14，而Gria1则相反，它在DIV28神经元中表达下调。

图2  circGRIA1和Gria1 mRNA表达呈负相关

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circGRIA1可以结合其亲本基因启动子

最近有研究表明，circRNA的基因调控功能是通过其与线性天然mRNA剪接所需因子的竞争性结合来实现。在这种情况下，它们是mRNA成熟的重要调节因子。为了探讨circGRIA1是否以顺式作用方式负向调节其亲本mRNA表达，作者采用染色质分离RNA纯化技术(ChIRP)，通过与circGRIA1环化位点互补的生物素标记寡核苷酸，来检测cicGRIA1共沉淀的基因组DNA。体内和体外实验均证实Gria1可以与cicGRIA1直接结合，因此，作者将分析的重点放在了Gria1基因元件的5'-UTR和3'-UTR区域。重要的是，对来自20岁猕猴海马组织裂解物进行circGRIA1的ChIRP时，回收到大量其亲本基因5'-UTR的PCR产物，尤其是比较于10岁猕猴海马组织。随后，对Gria1 5'-UTR的RT-PCR产物进行Sanger测序，表明cicGRIA1可以与其亲本基因的启动子区域相结合。值得注意的是，体外培养的胎儿猕猴海马神经元中过表达/敲低circGRIA1会显着增加/降低其与亲本基因5'-UTR的互作。

为了确定circGRIA1与其亲本基因启动子区域的结合是否影响其转录，将过表达Gria1 5'-UTR的pGL4.11载体与敲低circGRIA1的pLCDH-ciR或过表达circGRIA1的Tet-on circRNA载体，一起转染到不表达circGRIA1的SH-SY5Y 细胞中，24小时后，检测萤光素酶活性。作者发现荧光素酶活性的相对水平与之前的假设相符，即circGRIA1通过与Gria1基因启动子竞争性结合，而显著抑制Gria1基因转录。最后，使用RNA-DNA双荧光原位杂交（FISH），作者进一步验证了核circGRIA1与Gria1基因座的共定位，且DIV28的共定位显著高于DIV14。

图3  circGRIA1对其亲本基因座的调控

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CircGRIA1可以负向调节Gria1 mRNA的表达

作者使用BASEscope和RNAscope ISH来探索DIV14和DIV28的雄性胎儿猕猴海马神经元中circGRIA1和Gria1表达水平之间的相关性。接下来，作者设计并合成了靶向CircGRIA1环化位点的siRNA，将其与对照载体转染至DIV5海马神经元中。BASEscope 和BASEscope ISH信号平均强度的分析表明，在转染siRNA病毒颗粒的DIV28神经元中，circGRIA1和Gria1 mRNA表达分别显着降低和增高，而两者在敲低circGRIA1的DIV14神经元中均无变化，这可能由于circGRIA1水平在DIV14神经元中本身就较低。由于circRNA非常稳定，因此作者希望排除年龄相关的circGRIA积累对circGRIA负向调控其亲本mRNA表达的影响。作者采用了过表达的试验方法，western blot结果显示，过表达circGRIA1会导致DIV28和DIV14组的GluR1 蛋白水平显着降低。

图4  CircGRIA1负向调节Gria1 mRNA表达

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CircGRIA1可以抑制突触形成

大脑老化会伴随许多化学、生物学和结构的变化，包括突触形成。NMDA和AMPA受体活性是长时程增强和神经活动依赖性突触形成所必需的。为了探索circGRIA1和Gria1表达之间的负相关是否参与衰老状态下突触形成前后的调节，首先，作者在磁共振成像（MRI）的指导下，将靶向circGRIA1的siRNA病毒颗粒显微注射到10岁、20岁雄性和雌性猕猴海马中。6周后，使用BASEscope ISH、RNAscope ISH和qPCR 检测circGRIA1和Gria1的表达水平。结果表明，敲低circGRIA1会导致雄性而非雌性猕猴海马神经元中circGRIA1表达显着下调和Gria1 mRNA表达上调。接下来，作者检查了猕猴大脑中几种突触成分水平与年龄相关的变化。IHC结果显示，比较于10岁猕猴，synapsin-I和PSD9的表达在20岁雌性和雄性猕猴的海马（CA1和DG）中显著下降。尽管VAMP2的变化很小，但其他突触前后成分，包括synapsin-I、 synapto-tagmin-I、syntaxin-2、PSD95和neuroligin-1，均显示年龄相关的下调。

为了确定敲低CircGRIA1是否会阻止突触前囊泡蛋白synapsin-I和突触后蛋白PSD95的下调，作者对死后10岁和20岁的雌性和雄性CircGRIA1敲低猕猴的海马切片进行实验。敲低circGRIA1可以显着增加20岁雄性猕猴海马神经元中synapsin-I的水平，而非20岁雌性猕猴。令人惊讶的是，敲低circGRIA1的20岁雄性和雌性猕猴中PSD95水平几乎没有变化。体外实验与体内实验结果一致，在体外培养的雄性胎儿猕猴海马神经元中，过表达和敲低circGRIA1分别会导致synapsin-I的下调和显著上调，且并没有改变PSD95水平。尽管DIV28的海马神经元中synapsin-I和PSD95的表达显着降低，但在DIV5时，使用siRNA敲低circGRIA1仅会导致DIV28的神经元中synapsin-I表达显著增加，而对PSD95水平没有影响。

图5  敲低CircGRIA1会促进Gria1表达

图6  敲低CircGRIA1可促进突触形成

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CircGRIA1负向调节突触可塑性和钙稳态

突触可塑性的动态平衡与AMPA和NMDA受体介导的神经元活动密切相关。微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）的水平取决于形成的突触数量和/或突触前膜的囊泡释放率，因此可用来建模。在平衡状态下，mEPSCs的幅度取决于突触后谷氨酸的反应性或突触前突触小泡的谷氨酸含量，或者两者兼而有之。由于CircGRIA1不仅影响GluR1的表达，而且还调节突触前成分synapsin-I的密度，作者想知道CircGRIA1是否与突触可塑性的动态平衡相关。制备体外培养的胎儿猕猴海马神经元，在DIV5时，分别转染CircGRIA1-siRNA和对照载体。在转染后的不同时间点，追踪mEPSCs频率和幅度的变化。与DIV14相比，DIV28神经元的自发mEPSCs振幅和频率在对照组中正常降低。当在海马神经元中敲低CircGRIA1，会部分恢复自发mEPSCs振幅和频率。接下来，作者探索circGRIA1是否也通过 bicuculline（一种GABAA受体拮抗剂）来操纵神经元活性，进而促进GABAA受体阻滞引起的一系列变化。在DIV28的海马神经元中，bicuculline可以增强其兴奋性神经活动，导致mEPSCs振幅的稳态下降，但频率不变。有趣的是，bicuculline处理后的mEPSCs模式与自发mEPSC模式相似，bicuculline诱导mEPSCs振幅变化不受circGRIA1表达的影响。为了进一步验证上述结果，作者在DIV14和DIV28的海马神经元中诱导了化学LTP(cLTP)，发现雄性神经元中的CircGRIA1水平确实可以影响cLTP和mEPSCs。

年龄相关的神经可塑性缺陷与年龄诱导的钙稳态失衡密切相关。由于AMPA和NMDA受体都需要钙内流来发挥作用，所以钙稳态对神经系统非常重要。大量证据表明，谷氨酸受体信号诱导的钙稳态紊乱可能是大脑老化和阿尔茨海默病生物学中的一个致病因素。因此，作者试图确定CircGRIA1表达水平的增加是否可能在AMPA受体活性依赖的钙稳态紊乱中起到潜在作用。作者使用显微镜荧光计来检测雌性和雄性胎儿猕猴海马神经元中的Fura-2，Fura-2是细胞内钙离子（Ca2+）的特异性荧光指示剂。作者先用谷氨酸然后是100μM环噻嗪（CTZ，一种AMPA受体调节剂，与AMPA受体结合并使之脱敏）处理后，在6至8个神经元组中追踪Fura-2荧光。结果发现，细胞内神经元钙浓度增加并维持在150.9±33.8 nM（约为原始基线的1.5倍）。此外，在谷氨酸盐+CTZ处理后的DIV28的雄性胎儿猕猴海马神经元中，敲低circGRIA1会导致细胞内钙浓度显着增加，几乎恢复到DIV14神经元中的钙水平，其钙离子浓度维持在206.8±28.6 nM（约为原始基线的约4.1倍）。

图7  CircGRIA1负向调节突触可塑性和钙稳态

参考文献

1. Xu K, Zhang Y, Xiong W, et al. CircGRIA1 shows an age-related increase in male macaque brain and regulates synaptic plasticity and synaptogenesis. Nat Commun. 2020, 11(1):3594. Published 2020 Jul 17. doi:10.1038/s41467-020-17435-7

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