EMBO Reports | EB病毒编码环状RNA调控胃癌干细胞“干性”

8月12日，EMBO Reports杂志在线发表了一项环状RNA的重要研究工作，报道EB病毒编码的环状RNA可以调控胃癌干细胞的“干性”。文章的通讯作者是中山大学附属第三医院的邵春奎主任。

我们有幸邀请到本文的第一作者为我们做精彩的解读，并向大家分享了他们开展本项研究中的一些经验和心得，以下内容为文章作者撰写：

EB 病毒相关胃癌（EBVaGC）是胃癌四种分子亚型中的一种，具有独特的遗传学改变和分子标记，胃癌中构成比占10%。目前关于 EBV 致 EBVaGC 的分子机制尚不清楚。在本文中，作者在低剂量的化疗药物5-氟尿嘧啶压力下，通过在小鼠体内进行连续的移植瘤传代，筛选出耐药的 EBVaGC干细胞的细胞株，接着对这些肿瘤干细胞中病毒来源的环状RNA进行高通量测序分析。基于这一模型，筛选出高表达的EB病毒环状RNA ebv-circLMP2A，发现ebv-circLMP2A参与维持 EBVaGC 干细胞 “干性”生物学行为，并且 ebv-circLMP2A 的高表达与 EBVaGC 患者的淋巴结累及、远处转移、 TNM 分期以及较差的预后显著相关。进一步机制研究发现 ebv-circLMP2A 通过调控hsa-miR-3908/TRIM59/p53 通路维持 EBVaGC 干细胞 “干性” 生物学行为，从而促进EBVaGC的发生发展。本文的发现为靶向EBVaGC防治提供了新的治疗靶点。该研究针对病毒与肿瘤的关系这个热点问题开展工作，具有重要的科学意义。下面我们就详细了解一下这篇文章的主要内容：

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EBVaGC干细胞的富集与鉴定

肿瘤干细胞（CSCs） 具有自我更新和耐药特性，能够抵抗化疗药物的杀伤作用。基于这一规律，作者首先将EBVaGC细胞株SNU719接种到免疫缺陷的NOD/SCID鼠皮下，每周一次通过尾静脉给予低剂量化疗药物5-Fu，对照组给与同样剂量的PBS。当肿瘤生长到1.5cm时，取出移植瘤组织，进行原代培养获得肿瘤单细胞悬液。用上述同样的方法再次种植到NOD/SCID鼠皮下，并给予上述化疗，如此传代3次，筛选出富含化疗耐药的EBVaGC干细胞 的细胞株模型SNU-4th细胞。实验发现：SNU-4th 细胞的自我更新能力、单细胞成球能力、迁移和侵袭能力、克隆形成能力、在无血清培养条件下的增殖能力、侧群细胞比例均高于亲本 SNU719 细胞；SNU-4th 细胞具有稳定的 EMT 特性；通用干性分子标记（Klf4，Oct4，Bmi1，Sox 2 ）与耐药基因（ABCG2，Mrp1）的表达在 SNU-4th 细胞中显著升高。流式细胞术进一步分析发现 SNU-4th 细胞主要是由 CD44+CD24- 的细胞亚群构成。

图1 低剂量化疗压力下富集EBVaGC 干细胞（[1]）

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第四代异体移植瘤组织中EB病毒circRNA的表达谱分析

接下来，作者将富集 EBVaGC 干细胞第四代 5-Fu 处理和 PBS 处理的异体移植瘤组织进行环状 RNA 高通量测序，共鉴定出261个ebv-circRNA。与来源于人类基因组编码的环状RNA相似，大部分的ebv-circRNA 长度在300到600个核苷酸之间，主要来源于编码蛋白质的外显子。此外，同一个EBV基因可以产生多种由不同外显子或内含子构成环状RNA异构体。

图2 第四代异体移植瘤组织中EB病毒circRNA的表达谱分析（[1]）

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ebv-circLMP2A的发现

作者通过对测序数据的深入分析发现：EBV编码的潜伏膜蛋白基因LMP2A产生的circRNA（ebv-circLMP2A），其表达在5-Fu处理的第四代异体移植瘤组织中显著升高；进一步在SNU-4th、SNU719与YCCEL1细胞中进行验证，证明ebv-circLMP2A在EBVaGC干细胞SNU-4th中表达显著升高；后续分析ebv-circLMP2A的表达与EBVaGC临床病理因素及预后的关系发现，ebv-circLMP2A的高表达与患者的淋巴结累及、远处转移、TNM分期以及较差的预后显著相关。以上结果提示我们ebv-circLMP2A在促进EBVaGC进展中起到重要作用。

图3 ebv-circLMP2A 的环状特性分析及和临床预后的关系（[1]）

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体内外敲低ebv-circLMP2A可抑制SNU-4th细胞“干性”生物学行为

为进一步探索ebv-circLMP2A在EBVaGC 干细胞中的功能，作者设计了3条靶向ebv-circLMP2A反向拼接位点周围序列的sh-RNA。实验发现：在SNU-4th细胞中，干扰ebv-circLMP2A的表达后，可抑制 SNU-4th 细胞的球囊形成能力、迁移和侵袭能力、克隆形成能力、侧群细胞比例、通用干性分子标记（Klf4，Oct4，Bmi1，Sox 2 ）与耐药基因（ABCG2，Mrp1）的表达以及抗5-Fu诱导的凋亡能力。此外 NOD/SCID 鼠皮下移植瘤和肺转移模型显示，抑制 ebv-circLMP2A 的表达可以明显抑制皮下移植瘤的生长与肺部转移。

图4 干扰ebv-circLMP2A 表达后，可抑制SNU-4th细胞“干性”生物学行为（[1]）

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过表达ebv-circLMP2A诱导普通EBVaGC细胞株出现“干性”生物学行为

进一步，作者在普通的EBVaGC 细胞株SNU719与YCCEL1细胞中过表达 ebv-circLMP2A，Northern Blot检测过表达的效率。体内外实验进一步证实，过表达ebv-circLMP2A可诱导普通 EBVaGC 细胞株出现“干性”生物学行为。

图5 过表达ebv-circLMP2A 表达诱导普通EBVaGC细胞出现“干性”生物学行为 （[1]）

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ebv-circLMP2A通过海绵机制吸附大量miR-3908

作者在对ebv-circLMP2A进行环状特性分析时，发现其主要存在于细胞质中，这是circRNA发挥“miRNA Sponge”作用的前提。接下来，作者借助miRanda与TargetScan两个数据库对ebv-circLMP2A序列中miRNA识别元件进行预测并将预测结果重叠，筛选出7个候选miRNA，通过荧光定量PCR分析、RNA pull down实验、RNA 共定位实验发现miR-3908是ebv-circLMP2A的下游靶分子，双荧光素酶报告基因实验进一步证实ebv-circLMP2A主要通过位点1和3吸附miR-3908。

图6  ebv-circLMP2A通过海绵吸附miR-3908 （[1]）

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过表达miR-3908逆转了ebv-circLMP2A诱导的“干性”表型

为进一步了解miR-3908在ebv-circLMP2A维持EBVaGC 干细胞“干性”生物学行为中的具体作用机制，作者将miR-3908 mimic 转染到SNU-4th细胞中，发现过表达miR-3908可明显抑制SNU-4th细胞“干性”表型，进一步将miR-3908 mimic和ebv-circLMP2A共转染到SNU-4th细胞中，发现miR-3908可明显逆转ebv-circLMP2A对SNU-4th细胞“干性”表型的促进作用。此外，进一步在EBVaGC组织中分析miR-3908的表达和ebv-circLMP2A的关系，发现两者之间的表达呈负相关，miR-3908高表达患者其总生存率显著上升。

图7 过表达miR-3908逆转了ebv-circLMP2A 诱导的“干性”表型（[1]）

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ebv-circLMP2A通过抑制miR-3908表达参与上调TRIM59表达，最终导致p53蛋白表达下调

为进一步研究miR-3908抑制SNUN-4th细胞“干性”表型的下游通路，作者借助生物信息学技术和双荧光素酶报告基因实验发现TRIM59是miR-3908的下游靶基因。细胞水平上进一步证实了ebv-circLMP2A通过吸附miR-3908，上调miR-3908下游靶基因TRIM59的表达。在临床样本还发现TRIM59的高表达与患者的临床T分期显著相关。研究表明TRIM59在胃癌中高表达，并可通过促进 p53 蛋白酶体依赖的泛素化降解使得 p53蛋白表达下调，抑制 p53蛋白抑癌功能的行使，从而促进胃癌的发生发展。因此作者又进一步探索了ebv-circLMP2A对TRIM59下游分子p53蛋白表达的调控作用，实验发现，在高表达ebv-circLMP2A的临床样本中，其CD44+CD24- 的细胞比例升高，而p53+ 的细胞亚群显著减少，进一步证实ebv-circLMP2A最终通过下调p53蛋白的表达参与维持EBVaGC干细胞“干性”生物学行为。

图8 ebv-circLMP2A通过抑制miR-3908参与上调TRIM59表达，最终导致p53蛋白表达下调（[1]）

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ebv-circLMP2A维持EBVaGC干细胞“干性”表型机制汇总

在本研究中，作者利用CSCs对常规化疗耐药的特性，在低剂量的化疗药物5-Fu压力下，通过在小鼠体内进行连续的移植瘤传代，筛选出富含化疗耐药EBVaGC干细胞的细胞株SNU-4th，发现EBV来源的环状RNA ebv-circLMP2A其表达在5-Fu处理的异体移植瘤组织中和EBVaGC干细胞株SNU-4th中显著上调，并且ebv-circLMP2A的高表达与EBVaGC患者的淋巴结累及、远处转移、TNM分期以及较差的预后显著相关。机制研究发现ebv-circLMP2A通过调控hsa-miR-3908/TRIM59/p53通路维持EBVaGC干细胞的“干性”表型。

图9 ebv-circLMP2A维持EBVaGC干细胞“干性”表型机制汇总 （[1]）

研究经验分享：

编者问

这项工作研究过程中你觉得最重要，最困惑的问题是什么？你们怎么解决的？

Emma答

应该就是如何找到circLMP2A这个分子，当时测序数据中这个ebv-circRNA的表达并不是最高的，一开始选的是另外一个丰度最高的ebv-circRNA,但是当时在构建敲低载体时，发现这个circRNA的很难特异性敲低，后面比较难做表型。circLMP2A这个分子呢，其母基因本身就是一个非常著名的EB病毒致癌基因，在我们前期构建的移植瘤标本中又一致性上调，后来就选了circLMP2A往下做。

参考文献

1. Gong, L.P., et al., Epstein-Barr virus-derived circular RNA LMP2A induces stemness in EBV-associated gastric cancer. EMBO Rep, 2020: p. e49689.

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