13个课题组实名声明：无法重复韩春雨实验
编者按
一转眼，针对NgAgo基因剪切技术的争论已经持续五个多月了。在科学界，一项研究成果要想获得认可，必须经过同行评议和重复验证，这是科学对科研工作者的洗礼。正是这洗礼，保证了科研结果的正确有效，保证了人类的进步发展。今天，13位中国科学家本着严谨求实的态度实名公布他们无法重复韩春雨NgAgo实验，这是对科学共同体名誉的维护，更是对中国学界名誉的维护，体现的是中国科学家的担当。我们呼吁科研管理机构以此为契机，启动专业、规范的程序，针对学术质疑展开调查，推动我国学术道德调查的规范化、职业化。
“现在有重复失败的科学家向我们表示愿意实名。”“那就让他们实名说呗，他们要是愿意实名出来，我们就让重复实验成功的人实名出来。”这是昨天（2016年10月10日）《科技日报》备受关注的一则报道。
就在当天，来自中国科学院、北京大学、浙江大学、上海交通大学、华东师范大学、哈尔滨工业大学、温州医科大学等科研院所的13位课题组负责人实名公开表示，无法重复韩春雨今年5月2日发表在《自然-生物技术》上有关NgAgo的实验。这些科学家表示，这次声明是想提醒韩春雨和河北科大：作为同行，大家都在很认真地重复实验、验证技术，生怕因误解而给出的负面判断累及新技术发展。但同样作为科学共同体一员的韩春雨，也应尽快认真回应目前的科学质疑，完成作为论文通讯作者的责任和义务。
13个课题组同时发出声明
这次愿意站出来发表公开声明的13位学者分别是：北京大学生命科学学院教授魏文胜，北京大学生命科学学院研究员孙育杰，北京大学分子医学研究所教授熊敬维，中科院动物研究所研究员王皓毅、李伟，中科院生物物理研究所研究员王晓群，中科院生物化学与细胞生物学研究所研究员李劲松，中科院上海生科院神经科学研究所研究员杨辉，浙江大学生命科学研究院教授王立铭，上海交通大学教授吴强，华东师范大学生命科学学院研究员李大力，哈尔滨工业大学教授黄志伟，温州医科大学教授谷峰。
“不能再拖了，必须要发声，要让国际科学界看到我们这个领域（即基因编辑）中国科学家的态度。”这是13位学者的共同态度。
魏文胜说，在过去几个月内，他所在实验室的四五名学生，根据韩春雨论文里所提到的实验方法，做了多次、不同的尝试，但实验结果均没有发现基因组序列的改变，即“实验方法得不到重复的验证”。
中科院动物所研究员王皓毅的实验也得到类似的结果。针对韩春雨文章中“效率较高的三条gDNA”，他的两名学生，分别独立进行内源基因的编辑，却都无法检测到目标基因的突变。王皓毅说：“我们也尝试了二次转染gDNA，延长培养时间等，但都没有阳性结果。”
这可以说是大家最普遍的经历。吴强说，他们用PCR检测DNA片段DELETION，这个只要在体DNA片段编辑后，应该就能检测出，哪怕效率再低，但即使是这样也不行。李劲松说，有的同行甚至解析了NgAgo的结构，想找到它的功能位点，结果也没如愿。
王立铭说，虽然大家经历了种种失败，但这仍然只是一个学术争议，无论发生在中国、美国，还是日本，都应当有标准的学术规矩来处理。
谁有权有责对质疑进行调查？
今年5月2日，《自然-生物技术》发表了韩春雨有关利用NgAgo进行基因编辑技术的论文，称这是一种新的基因编辑工具，与目前实验室最为流行的基因编辑工具CRISPR-Cas9各具优势。论文发表之后立刻引来全球同行的广泛关注。很多国内同行都纷纷联系韩春雨，希望重复并跟进他的工作。可不久之后，各种无法重复实验的质疑声开始汇聚，最终引起《自然-生物技术》杂志的重视，发表声明要求韩春雨课题组“须将材料、数据、代码和相关的实验流程及时向读者提供，不可加以不当限制”。
8月3日，河北科技大学在接受《人民日报》记者采访时承诺，在一个月内，韩春雨将采取适当形式公开验证，届时将有权威第三方作证。然而迄今为止，《自然-生物技术》还没有进一步评论，杂志发言人称正在继续调查。
这是怎么回事？一位国际知名学术期刊主编告诉笔者，实际上，学术期刊一般没有权力、能力，也没兴趣对科学家的科研成果进行调查，除非论文遭到同行的高度质疑。比如，有的杂志会委托第三方进行重复，而更多的则是让科研机构自己来处理。
“其实，真正有责任和权力对成果开展调查的，是作者所在的单位，以及为课题提供经费的资助者。”他说，国际上通行的做法是，当某个成果引起较大争议时，首先考虑解决科学问题。一般情况下，作者所在科研机构或资助者会指定领域内公信度高的几个课题组，对实验进行重复。在此过程中，受质疑课题组应配合指导完成实验，如果不配合，就必须接受调查。如果指定课题组重复出实验，则同行认可该成果，继续向前推进；如果无法重复，至少从科学上给同行一个明确信号，避免大家无谓的投入——至于其中原因，留给机构和资助者去仔细调查，并妥善处理。
“这么做很有必要，不然会浪费更多纳税人的钱。”上海交通大学系统生物医学研究院教授吴强说，重复实验需要经费，如果韩春雨可以早点解开同行的谜团，也可以少浪费国家宝贵的科研经费。
浙江大学生命科学研究院教授王立铭在其个人微信公众号昨日发表的文章《关于基于NgAgo的基因编辑技术的个人声明》中评论说：对于负有监管责任的机构，包括为韩教授研究提供资助的国家自然科学基金委和河北省发改委，以及韩教授工作所在的河北科技大学，应该开展客观和全面的调查，检验其中是否存在学术错误乃至学术不端的行为。在这一点上，在著名的STAP干细胞造假事件中，日本RIKEN的态度可以借鉴。在该事件中，面对国际同行无法重复其实验结果的质疑，论文主要作者小保方晴子工作所在的RIKEN在几周内迅速开始调查，发现其博士论文和实验记录存在疑点后，第一时间宣布撤回学术论文，有效消除了不良影响。此后RIKEN又进行了耐心细致的调查，包括安排小保方在摄像头监督下重复试验、利用基因测序方法验证其论文使用的实验材料等等，最终给出了存在学术不端的结论，并严肃处理了相关责任人。事实上，只有这样深入全面的调查可以最终给韩教授清白，或最终确定韩教授的研究存在错误乃至不端。而实际上，找出真相并解决问题的过程不仅无损相关机构的声誉，反而能够更好地净化学术环境，维护学术共同体的信用。
值得注意的是，在河北科大的网站近日刚刚公布的“万人计划”候选人公示名单中，韩春雨被推荐为“中青年科技创新领军人才”。
呼吁公布重复实验成功者名单
刚看到韩春雨的论文时，王立铭非常开心和激动，他的实验室迅速索取了材料，并想推广到自己的研究中。可在此后的两个月内，他们先后测试了多达上百种实验条件，还根据韩春雨更新后的方法反复实验，可都没有观察到NgAgo方法对果蝇基因组的编辑活性。
他在上述声明中提出，从逻辑上说，NgAgo在果蝇胚胎中没有基因编辑活性，并不能证明NgAgo方法存在错误，更不能简单推导出韩教授团队存在学术不端。因为严格来说，他的课题组是在新系统中试图推广NgAgo方法的应用，而非简单地重复韩论文的结果。而更重要的是，判断学术错误乃至学术不端，需要更详细的信息和调查。但尽管如此，科学研究的成果，既然发表，就必须保证其真实无误可重复，公司的技术秘密可以讳莫如深，但一项公开发表的学术成果无法被同行顺利重复，非但没有价值，还会动摇整个学术共同体的生存基础——默认对方是诚信的、对方的研究成果是真实无误的。
中科院上海生科院生化与细胞所研究员李劲松也表达了同样的看法，他的课题组也绞尽脑汁，考虑了各种情况来重复实验，却得不到阳性结果。如果每项成果都要自己去验证之后才能采信，整个科研体系的效率将会低下得难以容忍。“科研本来就是容许试错的，但碰到问题大家可以一起讨论、探索，以提高整体科研效率。”他说，不少国际同行已经不再关注NgAgo技术——不浪费资源，要么等一篇系统否认该技术的论文出现，要么等有人确认技术可行。
但由于韩春雨一直没对质疑给出令同行满意的回应，有不少学者反映，近两三个月来，一些著名学术期刊要求中国科学家提供最原始实验数据的事件变得更加频繁。比对RIKEN对小保方晴子的严格调查，河北科技大学对韩春雨的信任给得少了些原则：连同行质疑都可以置若罔闻——世界同行将会怎样看待中国的科研诚信？
中科院院士、北京生命科学研究所学术副所长邵峰认为，这本来是学术界最常见的事情，已有非常成熟的处理方式，没有必要因为处理不当，而引发更多波澜。
出于上述种种理由，业内呼吁韩春雨公布重复实验成功者名单，让事件回归到简单而纯净的学术探讨。
1 北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA，同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞，2天及5天后，用T7E1检测切割效率，这三条针对2个不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa两个细胞系中，无论转染一次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA，都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因，我们设计了ssDNA，与NgAgo表达质粒共转HeLa细胞5天后，发现细胞表现出了一定的对应表型，但是把这部分细胞收集起来提取基因组，对靶位点测序，没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA，用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生，结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2 中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在293T细胞中表达带有Flag标签的NgAgo ，在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发现转染6小时后开始检测到目的蛋白，随着时间的延长蛋白量增加。在人类293T细胞系中重复原文章中Figure 4b中NgAgo对DYRK1A和GATA4两个位点的基因编辑，使用文章中发表的guide DNA (gDNA)。具体实验方法为NgAgo分别与相应的gDNA共转染细胞，6h、12h后进行相应gDNA的再次转染。转染后3-4天收集细胞进行Surveyor assay，未检测到目标位点目的条带的切割, 测序也未发现突变。结果未能重复Figure 4b。
我们也进行了原文章里的Figure 3切割GFP质粒的实验，使用文章中的eGFP gDNA G3，转染2天后，观察荧光表达和进行流式检测， NgAgo+gDNA G3，NgAgo+ 靶向其他位点的gDNA ，pUC19+G3， pUC19+5’端没有磷酸化修饰的gDNA，以及单独转染gDNA 都能够明显降低eGFP表达。针对质粒目标位点的genotyping（Surveyor assay，PCR以及测序），未检测出任何突变。结果未能重复Figure 3 .
我们所使用的细胞定期进行支原体检测，未发现任何细胞污染。
3 中科院上海生科院生化与细胞所李劲松课题组
我们主要做了两方面的实验：一个是在Oct4-EGFP的小鼠受精卵中进行NgAgo mRNA和gDNA的注射，尝试了不同的浓度组合，在囊胚的时候也有看到不亮或者发光很弱的情况，但是测序发现序列并没有突变；另一个是在细胞水平，我们最初是在Oct4-EGFP的单倍体细胞共转NgAgo和gDNA载体，分选双阳性的细胞直接测序或者培养后测序，均没有突变。我们开始怀疑NgAgo的表达窗口比较窄，就改造载体建立了稳定表达Ago的细胞系，依然没有突变。后面我们就完全按照NBT文章里的实验，在293T细胞中打靶hDYRK1基因，gDNA的长度位置都和文章一样，还是没有能突变。
4 浙江大学声明科学研究院王立铭课题组
我们实验室在韩春雨论文发表一周内就索取了NgAgo的DNA载体，并立刻计划了对NgAgo方法的测试。在两个月多达上百次的实验中，在我们测试的所有条件中，我们都没有观察到NgAgo方法对果蝇基因组的编辑活性。
5 北京大学生命科学学院孙育杰课题组
我们使用了原始菌里来源的和人工合成的密码子优化的NgAgo，尝试了公司合成的磷酸化gDNA和自己使用PnK磷酸化的gDNA切割MDA_MB-231细胞中的laminB1和LBR基因，每个基因五条gDNA，通过T7 assay均未见切割。同时，我们切割整合在基因组的gfp基因，使用韩春雨文章所用的gDNA，流式检测也无gfp荧光的下降。我们还将NgAgo融合了荧光蛋白，使用靶向telomere的gDNA，使用高倍荧光显微镜没有发现NgAgo在telomere处的富集。
6 中科院动物研究所李伟课题组
我们在哺乳动物细胞和胚胎水平进行了基于NgAgo的基因组靶向突变实验，采用了包括韩文章中报道的293细胞和4个完全相同的guide序列和，结果均为阴性，均没有检测到靶向DNA突变产生。具体进行的实验包括：1、利用体外原核表达纯化的NgAgo和韩文章中报道的4个guide序列进行37°单链DNA切割，结果：37°没有检测到DNA切割。2、哺乳动物细胞实验。按照文章附件中的方法，在293细胞分别转染韩文章中的 G5,G10,G27,G28和自己设计的Mecp2基因guide序列，T7EI酶切检测没有检测到靶位点突变。进行guide-DNA连续转染实验，在转染后8h,12h 补充转染guide 依然没有检测到靶位点的突变。3、小鼠胚胎实验：选取Mecp2和stella 位点分别设计若干guide序列，连同NgAgo mRNA一起进行细胞质注射，收取囊胚检测，T7EI和测序分析均没有检测到靶位点突变。
7 中科院上海生科院神经科学研究所研究员杨辉课题组
我们针对小鼠胚胎的GFP基因、Tyr基因分别设计了四个gDNA（在三家公司都试过合成了），NgAgo用了三种不同版本（密码子优化或者NLS在N端、C端），操作几百个胚胎，生了三百多只小鼠，都没有检测到敲除。之后我们又在细胞水平针对猴的Tyr基因、293的GFP基因、N2A的Tyr基因进行操作，也没有检测到任何基因编辑。最后我们完全按照韩文章中fig4的DYRKIA基因进行操作，也完全没有效果。
8 上海交通大学吴强课题组
TtAgo被发现在高温下可以在体外通过gDNA指引内切单链DNA，PfAgo在高盐条件下可以切DNA单链，NgAgo可能是一种嗜盐碱古杆菌中含有类似RNaseH结构域的单链RNA内切酶，但也可能内切DNA单链。我们利用密码子优化后合成的NgAgo做了以下体内编辑实验，我们没有做体外实验：
1 单位点：不管是人工合成的5‘端磷酸化gDNA，还是利用T4 PNK磷酸激酶磷酸化5’端羟基得到的gDNA，在小鼠胚胎、小鼠N2A细胞、人HEC-1B细胞中均没检测到活性。
2. 双位点：三个学生花的力气最大。至少做了三个不同的DNA片段，做了不同温度、盐离子浓度、多次转染、先体外合成NgAgo蛋白再转染、不同的Tag或核定位序列，也试了不同的细胞系。我们是用PCR检测DNA大片段敲除，这个方法很灵敏（用CRISPR/Cas9很容易做出来），因为只有在片段敲除的情况下才能扩增出PCR产物，哪怕效率很低也应该能检测出来。PCR产物经过克隆再测序，但从没有检测出片段敲除的正确结果。
9 温州医科大学谷峰课题组
我们利用携带GFP的人类细胞，同时导入磷酸化的gRNA和NgAgo表达质粒（做了多个不同浓度梯度和重复），希望特异的看GFP敲除，以CRISPR/Cas9做阳性对照，但是NgAgo组我们没有能够检测到GFP的失活。这个实验我们后面又重复了，但是仍然没有看到切割。所以此时，我们高度怀疑NgAgo的活性，该项目就先停了。
13位科学家实名呼吁对韩春雨启动调查：为了中国学界的名声
河北科技大学副教授韩春雨（供图：澎湃新闻）
这是一场和时间的赛跑。这场赛跑赌上的，是中国学术界在国际上的名声。
一切源于2016年5月2日，河北科技大学副教授韩春雨课题组在国际顶级期刊《自然-生物技术》上发表了NgAgo基因编辑技术的论文。刚发表时，NgAgo被认为是新一代基因编辑工具，可媲美此前有“基因魔剪”美称的CRISPR技术，被国内部分媒体誉为“诺奖级”学术成果。 然而，之后的故事急转直下，全球数百家实验室，历时5个月的时间，没有一家宣布能重复成功。质疑声越来越大，韩春雨不作正面回应，却收获接连的荣誉：河北科协副主席、美丽河北最美教师、100万元国家自然基金......受惠于NgAgo技术，河北科大获得了河北发改委2.24亿元的财政拨款，用于建设河北科技大学基因编辑技术研究中心。
“是时候了，”北京大学生命科学学院教授魏文胜对澎湃新闻和中国青年报表示，科学家有必要站出来表达看法。“处理不好的话，会严重影响中国科学家的声誉。”魏文胜表示，他愿意聊聊他所了解的NgAgo。作为国内基因编辑领域的领军人物之一，魏文胜在《Nature》、《Cell》等国际顶级期刊发表过研究成果。
不只是魏文胜，总计13位中国生物学家决定实名发声。他们是：
北京大学生命科学学院教授魏文胜，北京大学生命科学学院研究员孙育杰，北京大学分子医学研究所教授熊敬维，中科院动物研究所研究员王皓毅、李伟，中科院生物物理研究所研究员王晓群，中科院生物化学与细胞生物学研究所研究员李劲松，中科院上海生科院神经科学研究所研究员杨辉，浙江大学生命科学研究院教授王立铭，上海交通大学教授吴强，华东师范大学生命科学学院研究员李大力，哈尔滨工业大学教授黄志伟，温州医科大学教授谷峰。
他们来自不同的研究细分领域，都在NgAgo诞生伊始跟进重复和验证，大多耗时两个月，数次重复和验证无一例外地全军覆没。
这13位生物学家一致表示了希望韩春雨能公开所有原始数据，韩春雨所在河北科技大学及其他相关单位（如：国家自然科学基金委员会）启动学术调查。
澎湃新闻分别联系了韩春雨、河北科技大学和国家自然科学基金委员会。截至发稿前，韩春雨、河北科技大学和国家自然科学基金委员会皆未回复澎湃新闻的置评请求。
所谓基因编辑技术，也就是说NgAgo能对基因进行敲除、插入等改造工作。据韩春雨在论文中描述，NgAgo在40多个位点保持了可媲美上一代基因编辑技术CRISPR的高效切割，即21.3%−41.3%的效率。
科学发表是文责自负（作者对其发表文章的真实性承担全部责任）的。在论文刚发表时，魏文胜曾正面评价过韩春雨的工作。但意外的是，实验室4、5个学生经过“各种不同的尝试”，包括重新设计去调整优化，历时2、3个月，没有发现一个基因出现基因编辑现象，“完全没有阳性的结果”。在圈内了解其他实验室的验证情况后，魏文胜发现国内外这些尝试过的实验室无一成功。
魏文胜向澎湃新闻分析道，面对学术质疑，作者还是有义务回应的。技术方法学论文和生物机制研究不同，后者在数据解读方面容易产生歧义，在实验重复性方面往往需要较长时间的验证来证明（或者证伪）；然而技术及方法学论文的验证通常比较直接，当一个方法被报道为高效的方法，那么其可重复性和高效性都必须得到同行证明。在有质疑的情况下，当事实验室通常会积极配合，自我查纠。所属研究机构/学校以及研究资助方也会督促检查。到目前为止，在国内外如此强烈的质疑声中，没有任何调查行动，反而当事方频获奖励、荣誉及巨额资助，令人费解。
魏文胜向澎湃新闻分析道，出现这样的现象，有3种可能：
1.NgAgo技术是高效的基因组编辑技术，但国内外至少上百家实验室的效率为零，唯一可能是相关课题组隐瞒了关键的实验步骤；
2.NgAgo技术能够工作，但是效率很低；而国内外至少上百家实验室的尝试为不工作，则课题组在论文中严重夸大了NgAgo的效率；
3.完全不工作。
对于第一种情况，隐藏关键实验步骤意味着什么？魏文胜解释：“这是严重的学术不端。”
浙江大学生命科学研究员教授王立铭是2014年的国家“青年千人计划”，他遇到了相同的问题。看到NgAgo论文后，他和合作者们怀着激动的心情，开始测试NgAgo方法能否用来定点编辑果蝇胚胎的基因组。果蝇遗传学研究是王立铭实验室的专长，王立铭坦言，他和合作者们最初没有试图去复盘韩春雨的实验，因为“基于对科学共同体成员的基本信任，科学同行在分享研究成果时自然会首先默认对方是诚信的、对方的研究成果是真实无误的。否则一切学术交流和成果分享都无从谈起。”
他和合作者们曾经成功地使用前三代基因编辑技术（ZFN、TALEN和CRISPR/cas9）对大量果蝇基因进行了高效率得编辑。但在被誉为第四代基因编辑技术NgAgo上，王立铭和合作者们先后在两个月时间内，测试了上百种实验条件，试过不同的基因组位点、基因编辑路径、成分配比等等，皆无起色。“在我们测试过的所有条件中，我们都没有观察到NgAgo方法对果蝇基因组的编辑活性。”
中科院动物研究所研究员王皓毅尝试过完全按照韩春雨论文中的要求进行实验，“我有两个学生，独立地在重复，严格地按照他（韩春雨）发表的细胞系中，使用文章中报道效率较高的三条gDNA进行内源基因的编辑，我们也尝试了去改进（二次转染gDNA、延长培养时间等），但没有阳性结果。所以我们也就不想再在这上面浪费时间了。”
此前，在分析NgAgo技术为何出现大面积无法重复时，曾有业内人士从科学角度分析，韩春雨论文中称NgAgo可引发宿主染色体靶向位点的DNA双链断裂，这或许缺乏事实依据和理论依据。
哈尔滨工业大学教授黄志伟从事结构生物学方向的研究，他对通过NgAgo“编辑”的200个左右的克隆进行了测序，仅发现有几个克隆有点突变，并没有看到基因敲除和插入。黄志伟说，NgAgo是韩春雨通过Ttago基因催化位点的保守性找到的，如果把保守催化位点氨基酸突变掉，NgAgo应该没有活性。但黄志伟告诉澎湃新闻，韩春雨曾“亲口”告诉他，“NgAgo突变体还有活性”。黄志伟认为“这也很不合乎常理”。这也说明NgAgo的所谓“活性”或许不是来自于它本身。黄志伟认为，这也可能解释了韩春雨文章中，没有突变体或者没有不加NgAgo对照实验的原因。
北京大学生物动态光学成像中心研究员孙育杰的实验室专长荧光成像，近来一直致力于发展和使用基于CRISPR和TALEN等基因编辑技术实现染色质DNA的荧光标记，相关成果已经发表。在韩春雨论文发表后，孙育杰实验室也跟进了。在向澎湃新闻描述他的跟进结果时，孙育杰表示，自己所在的实验室尝试用NgAgo去切割两个内源基因以及整合在基因组的gfp基因，都没有做出来。
更重要的是，作为其实验室最在行的荧光成像，也就是用NgAgo去做基因位点标记时，他们发现用NgAgo无法标出端粒，这意味着“NgAgo未必有结合和打开双链DNA的能力”。
孙育杰进一步解释：端粒有一个特点，它有数千个重复片段，如果用CRISPR或者TALEN这样的技术去target（靶向）端粒的重复片段的话，由于它有上千次重复，数百、上千个CRISPR或TALE会富集在那些位点，所以在荧光显微镜下一眼就看见了，并且这一结果在世界上多个实验室都已重复出来并发表在多篇文章中。现在对端粒设计NgAgo，我们看不到它上去。“我们这个实验，基本上可以推测出NgAgo没有结合双链DNA的能力。”孙育杰说。（本文经“澎湃新闻”授权转载。）
① 中外实验室均无法重复，韩春雨事件就这样落幕？
② 河北科大应启动对韩春雨的学术诚信调查：这是对他的最好保护
③ 河北科技大学承诺公布验证时间已到，韩春雨事件未了——韩春雨事件时间表
④ 《自然-生物技术》就韩春雨实验发表声明，将按既定流程调查此事
⑤ 多国科学家宣布：迄今未能重复韩春雨NgAgo实验结果
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