EpiFocus | DNA与电化学的美丽邂逅：DNA电荷转运

2月24日，Science上发表了一篇题为The [4Fe4S] cluster of human DNA primase functions as a redox switch using DNA charge transport的文章。

这篇文章讲了人DNA引发酶中的[4Fe4S] cluster通过「DNA电荷转移」而作为一种氧化还原开关。这里涉及一个非常具有前景的领域：DNA与电化学的美丽邂逅——DNA电荷转移！鉴于2016年的诺贝尔化学奖授予给了【分子机器的设计与合成】，因此小编预言，DNA电荷转移也很有可能获得诺贝尔化学奖！今天将为大家详细解读这篇文章，希望大家能够对DNA电荷转运概念和作用机制有一个基本的认识。

核心作者

Jacqueline K. Barton

本文的核心通讯作者：Jacqueline K. Barton，现为加州理工大学教授。她是地道的纽约人，1974年以最优等荣誉毕业于伯纳德学院。（注：伯纳德学院是哥伦比亚大学的本科学院之一；而最优等是美国大学授予本科生的最高荣誉，通常绩点大于等于3.8才可能拿到；可见Jacqueline K. Barton是个名副其实的学霸。）

从此她的人生就像开挂一般，本科毕业后升入哥伦比亚大学继续学习，4年时间拿到无机化学博士，随后在贝尔实验室和耶鲁大学做了两年的博士后，1980年开始在纽约城市大学（City University of New York）任助理教授。两年后再次回到哥大，并且在进入哥大的两年后就已经成为副教授，三年后，成为正教授，而且是哥大化学系首位获得终身制的女教授，又过了三年，她转到加州理工，1997年成为正教授，2009年成为化学化工系主任（Chemistry and Chemical Engineering）。

她研究兴趣包含：DNA结合探针的合成和表征；DNA介导的电荷转运的生物学功能（也是这篇文章所涉及的领域，她是这个领域的核心开拓者，实际上，如果DNA介导的电荷转运获得诺贝尔奖的话，Jacqueline K. Barton必定当选。她1952年出生，现年65岁，能否得奖还得取决于她的身体状况。）；DNA薄膜的电化学。

图为2011年Jacqueline K. Barton获得美国“国家科学奖”的场景

Jacqueline K. Barton获奖颇丰。其中，2011年获得美国“国家科学奖”，获奖理由是“For discovery of a new property of the DNA helix, long-range electron transfer, and for showing that electron transfer depends upon stacking of the base pairs and DNA dynamics. Her experiments reveal a strategy for how DNA repair proteins locate DNA lesions and demonstrate a biological role for DNA-mediated charge transfer.”

2015年，Jacqueline K. Barton又斩获一重量级奖项：普里斯特利奖章（Priestley Medal）。普里斯特利奖章是美国化学会的最高荣誉，类似于很多领域的“终身成就奖”。（备注：普里斯特利是氧气的发现者，一说是舍勒。）

Walter Chazin

文章另一位通讯作者为美国范德比尔特大学的Walter Chazin, 从事结构生物学研究，主要手段是核磁共振（NMR）和X射线衍射。第一作者为Elizabeth O'Brien，来自Jacqueline K. Barton实验室，2012年从宾夕法尼亚大学毕业。

基础概念

回到论文本身：The [4Fe4S] cluster of human DNA primase functions as a redox switch using DNA charge transport。首先，题目中有几个关键的名词引起了我的兴趣！何为DNA primase？何为4Fe4S cluster？什么又是Redox swith?什么又是DNA charge transport呢？

DNA primase

DNA primase是一种DNA依赖的RNA聚合酶，其发挥作用的主要场景为DNA复制。
DNA复制是一个非常复杂的多步骤过程：leading上，沿着模板链，以5’-3’合成；而对于lagging strand，情况就复杂很多。

而Primase通过与DNA Polα形成二聚体（共包含四个亚单元）发挥功能。

主要步骤包括：1. DNA primase以单链DNA为模板，合成8~12nt的RNA primer，并把这一段RNA递交给DNA Polα；2. 随后Polα利用dNTP为原料，把这一段延伸至~20nt；3. 随后在Polδ和Polε的作用下，开始快速，持续的延伸。

[4Fe4S] cluster

第二个关键概念是4Fe4S。顾名思义，这是铁原子和硫原子形成的一种化合物。Fe-S形成的cluster一共有三种形式：[2Fe–2S] ，[3Fe–4S]，[4Fe–4S] 。

Fe-S是一个非常古老的组分，在40亿年以前的冥古代（自地球形成至距今40亿年前这段时期），地球处于无氧状态，地壳组分中含有丰富的铁元素和硫元素，因此也被称为Fe-S世界。

除了Fe-S，此外还含有大量的H2和CO2。H2可作为电子供体，而CO2作为电子受体，它们与Fe-S化合物共同发生一种原始的乙酰辅酶A通路反应，这个过程可以生成H2O，并且产生了C-C键，即原始有机物的雏形。因此，现在普遍认为：Fe-S cluster对于原始生命的形成具有非常关键的作用。

[4Fe–4S] clusters是一种蛋白辅助因子，可以被组装和加载到与DNA加工相关的蛋白中，可以发挥多种功能。但是好景不长，大气中的氧气会把Fe-S氧化，一旦氧化，其活性就很低；此外，铁离子也会对DNA造成损伤，破坏DNA的完整性。因此在进化过程中逐渐被淘汰，替换为对氧气不敏感的Zn离子。因此，我们现在可以看到，很多蛋白都是锌指蛋白。

但是，Fe-S cluster真的在进化过程中消失了么？实际上，从20世纪60年代开始，科学家在一些蛋白中发现了一些蛋白中含有Fe-S cluster的蛋白。包括我们今天要重点讨论的DNA Primase。（为什么一会儿p48，一会儿p49，因为命名是按照蛋白分子量大小，这个亚单元大小介于48kD和49kD之间，因此即可以叫p48，也可以叫p49。无论是以p48，还是p49为关键词，都可以找到大量的相关文献。）

Redox switch

在有机化学里我们学到：氧化还原反应的实质是电子的转移。失去电子的反应为氧化反应，得到电子的反应为还原反应。但有得必有失，因此氧化反应和还原反应总是共存的。我理解的氧化还原开关指的是通过氧化还原反应改变生物分子的功能。

DNA charge transport

什么是DNA电荷转移呢？DNA的分子基础是脱氧核糖核苷酸，通常酸的H+可以解离，因此DNA带负电；DNA可以作为一种电荷转运的导体，通过碱基的堆积作用，在长范围内传递电子。其实，我们发现，DNA被赋予了很多新的功能，比如这里的导体，以及我们之前讲解过的DNA可作为信息存储媒介。

论文详解

我们刚才提到，DNA primase在DNA复制过程中如此重要，那么肯定有很多相关研究。首先，从结构生物学角度，无论是primase的单个subunit，polα的单个subunit，还是primase自己的异二聚体，以及primase和polα共同形成的复合物的晶体结构都已经被解析出来；其次，从结构生物学角度关于primase催化亚单元的催化机制，也已经研究的很透彻。

此前的研究没有回答的问题是：1. DNA primase，polα, Polδ和Polε在不同工作状态下构象的变化？2. primase把新生的RNA primer递交给polα的化学本质是什么？3. 人源的primase中[4Fe4S] cluster的生物学功能又是什么？

对于第一个问题，本文没有进行解读，第二个问题和第三个问题可以放在一起解读。作者猜测：人源的primase中[4Fe4S] cluster是否可能通过某种电化学反应介导了primase把新生的RNA primer递交给polα的过程。

研究工具：DNA介导的电化学

DNA介导的电化学是作者常用的研究模型。上图一个芯片，每一个小圆圈代表一个Au电极，一共有16个Au电极，分布在芯片的4个象限。

放大来看，金电极表面是通过巯基固定的，末端由硫醇终止的双链DNA。上图是人的primase中包含的4Fe-4S cluster，其氧化还原状态可以影响与DNA的结合能力。前面提到了，氧化还原反应就是一个电子转移的过程，那么当dsDNA末端发生电子转移时，可通过碱基的堆积作用，把电信号传递到金电极。因此，分布在4个象限的金电极，通过不同的组合，可以比较氧化状态、还原状态、基态以及反复的氧化还原循环样品。

循环伏安法：记录氧化还原反应电流变化

Au电极上的电流如何记录？如何判定与dsDNA结合的是氧化态的物质还是还原态的物质呢？这里使用的是【循环伏安法】：一种是改变电位以得到氧化还原电流方向的方法。通常这样的系统里面含有3个电极：工作电极，辅助电极（counter electrode）以及参考电极（本文使用的是Ag/AgCl参考电极）。在实验过程中，通过改变参考电极的电位，随后测量工作电极和辅助电极之间的电流。

循环伏安法采用的是三角形电位，即电位先随着时间均匀增加，随后以相同的速率降低至起始电位。当参考电极电位升高的时候，发生还原反应，即从[4Fe4S]3+——>[4Fe4S]2+，阴极电流升高；相反，当参考电极电位降低时，发生氧化反应，即[4Fe4S]2+——>[4Fe4S]3+，阳极电流升高，产生一个阳极峰。

电解库仑法：设置反应的标准起始态

但是，这里存在一个问题，如何保证每一次实验前，反应起始状态都是一致的，而且是我们想要的氧化还原状态。这里就要利用电解库仑法（bulk electrolysis），即在电池的两个电极上，外加一定的直流电压，使得电解池中的化学反应朝着非自发的方向进行，电解质中的介质在两个电极上分别发生氧化还原反应。

作者先做了一个测试：首先，施加一个高于标准氢电极的电位（applied potential Eapplied = 412 mV versus NHE），让所有与dsDNA结合的样品处于氧化状态。随后加一个扫描电位，可以看到一个阴极峰，说明发生了这个还原反应。而一旦还原反应发生结束了，即全部变成[4Fe4S]2+以后，可以看到没有峰出现，暗示还原态的[4Fe4S]2+不能跟dsDNA结合了。类似的，现在一开始就给一个低于标准氢电极的电位（-188mV），看不到阳极峰出现。

结果1：Redox state of the [4Fe4S] cluster alters its DNA binding affinity

作者为了证实这一核心理论，把这个现象又重复了5遍，得到了类似的结果。

Result 2: Key residues in Charge Transport pathway

好了，到了这里，我们发现，4Fe-4S cluster的氧化还原状态可以决定其与DNA的结合亲和性，而且这个过程是通过电荷转移实现的！

那么问题来了：4Fe-4S cluster与DNA并不是直接作用，其与DNA模板之间有一道约25Å的鸿沟，那么这种电荷转移一定有一个通道，而且这个通道是p58C中的核心氨基酸残基决定的。

但是，如何找到它们呢？首先，从结构生物学角度，它们要有合适的位置；其次，从电化学角度，如果想要很灵活地介导这样的氧化还原反应，这些残基需要有较低的电离能；最后，从进化角度，如果这些残基在高等生物中保守，那么也提示它们有重要功能。

从电化学角度，含有芳香环的分子具有较低的电离能，比如酪氨酸；进一步，从结构和进化角度，找到了3个候选的位点，Y309, Y347, Y345。

Result 2.1 Validating proper folding of the Y-F variants

想要证明p58C中的这3个关键碱基对于DNA电荷转运非常关键，这一点看起来很容易，不就是做几个突变么？但是，通常会引来很多质疑，比如：1. 这几个位点突变后，可能会影响p58C的带电；2. 可能会影响p58C的结构，进而影响4Fe-4S cluster加载到p58C中。

首先在选择突变时，将酪氨酸突变为跟它具有相似电离能的苯丙氨酸（Phe, F）,此外，作者还增加了一个突变，将345的酪氨酸突变为半胱氨酸C，因为这个突变在胃癌中鉴定过。其次，需要验证突变后p58C的二级结构与WT的基本一样，而且不影响与dsDNA的结合。

验证的时候，首先利用圆二色谱检测不同蛋白的波谱吸收，发现在不同波段，这些突变型与野生型的CD几乎完全重合；其次，利用紫外-可见光谱检测在280nm处的吸收峰，发现也基本相同，说明4Fe-4S cluster加载到p58C的量也基本相同。

Result 2.2: Structure is not perturbed when mutations occur

如果觉得刚才的结果不够直观，那么作者给出了最有力的证明，作者解析了WT, Y347F, Y345F三种蛋白的结构，并进行重叠比对，发现这些关键的氨基酸在突变后，采取了同样的构象。进一步验证了突变不会影响p58C的结构以及4Fe-4S的结合。

Result 2.3: Y345, Y309, Y347 aid in charge transport

接下来，作者需要验证这几个突变对电荷转运到底有什么影响！

回顾一下刚才的研究策略：首先，通过电解库仑法，给一个高于标准氢电极的电位，让[4Fe-4S]都呈现氧化态，随后，利用循环伏安法进行扫描。如果这几个氨基酸可以影响电荷转运，那么在第一步，[4Fe-4S]不能充分氧化，因此与dsDNA结合的三价的[4Fe-4S]相应减少；这已经可以让随后的循环伏安法中的电流信号衰减了；但与此同时，当给三角形扫描电位时，也会影响电荷转运，因此信号也会衰减。

结果也印证了这一点，这几个位点的突变，会显著影响电荷转运情况。

Result 3: Redox switch is required for initiation

此前我们提到含有[4Fe-4S] cluster的DNA primase参与两个过程：DNA复制起始，即利用DNA模板链合成RNA；其次，将这段RNA primer交给polα，继续延伸至~20nt。作者想知道，4Fe-4S的氧化还原开关对哪一个过程重要？首先，作者检测是否对DNA复制起始是必需的！

ssDNA Initiation Substrate: 3’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAGAGAGAGAGAGAGAGAAAAGA-5'

作者做了一个无氧的核苷酸掺入实验：通过检验同位素标记的A掺入DNA链的效率检测DNA的起始。（这里特别提到无氧环境，是因为大气中的氧气可以将[4Fe-4S] cluster氧化。）

对于DNA复制的起始，即DNA primase是否能合成7~12nt的RNA链，并把RNA primer递交给polα（此时约为25nt）。可以看到，突变型的DNA primase对于DNA复制的起始作用明显降低。

Result 3.1: Rate-determining initiation step in product synthesis is inhibited for mutants deficient in the redox switch.

这是对前面胶图的量化，其中突变型对于DNA复制起始的总合成量（7~10nt的RNA primer以及25nt的DNA-RNA链都算进去）明显比WT组低。

而在每个突变型内部，primer长度的成分（即RNA primer, 7~10nt）所占的比重更高，即突变型更倾向于合成更短的序列，暗示将RNA primer递交给polα的过程可能是个限速步骤。

Result4:Amismatch in the nascent primer inhibits primase truncation.

随后，作者希望指导，当新生链中存在错配时，是否会影响DNA primase对新生链的截断作用（即合成到约为30nt，随后递交给Polδ和Polε继续延伸）。

其中，U =2’-OMe rU

结果发现，错配会导致产生更少的截断的DNA。

Result 4.1: DNA charge transport regulates truncation and handoff

对于正常配对的DNA，首先，氧化态的4Fe-4S cluster与DNA结合, 随后在相应的partner作用下，发生还原反应，变成还原态的4Fe-4S cluster，因此离开DNA，而这一段时间，刚好可以完成RNA primer合成和递交给Polα，因此会出现截断；而对于存在mismatch的DNA，由于DNA介导的电荷转移不能正常进行，氧化态的4Fe-4S cluster不会被还原，因此持续地与DNA结合，产生更长的产物。

由这篇文章想到的

1. DNA primase could bind both ssDNA and DNA-RNA duplex;

DNA primase的这种即能结合ssDNA，也能结合DNA-RNA duplex的特性非常值得关注，而且新合成的链中，是DNA-RNA的嵌和链。

2. If those experiments performed in magnetic field?

变化的磁场可以产生电场，变化的电场可产生电流，进而影响DNA的碱基堆积。

3.Can DNA modifications affect the DNA CT?

文章中，一个DNA错配就可以影响电荷转运，那么DNA修饰呢？

4. Can this system also be applied to RNA and protein, i.e. RNA/protein charge transport?

既然DNA可以作为电荷转运的导体，那么同样带电的RNA链和肽链呢？

参考文献：

1. O'Brien E, Holt ME, Thompson MK, et al. The [4Fe4S] cluster of human DNA primase functions as a redox switch using DNA charge transport. Science. 2017, 355(6327). pii: eaag1789.

2. Coloma J, Johnson RE, Prakash L, et al. Human DNA polymerase α in binary complex with a DNA,DNA template-primer.  Sci Rep. 2016, 6:23784.

3. Kim JH, Bothe JR, Alderson TR, et al. Tangled web of interactions among proteins involved in iron–sulfur cluster assembly as unraveled by NMR, SAXS, chemical crosslinking, and functional studies. Biochim Biophys Acta. 2015, 1853(6):1416-28.

4. Fuss JO, Tsai CL, Ishida JP, et al. Emerging critical roles of Fe–S clusters in DNA replication and repair. Biochim Biophys Acta. 2015. 1853(6):1253-71.

5. Baranovskiy AG, Zhang Y, Suwa Y, et al. Insight into the Human DNA Primase Interaction with Template-Primer. J Biol Chem. 2016. 291(9):4793-802.

6. Arnold AR, Grodick MA, Barton JK. DNA charge transport-from Chemical Principles to the cells. Cell Chem Biol.  2016. 23(1):183-97.

7. https://www.csun.edu/~jeloranta/CHEM351L/experiment3.pdf

【The End】