转录因子：阅读遗传信息的书签！（一）
今天给大家安利一篇发表在 eLife 上的文章：
这篇文章的通讯作者为加州伯克利分校的 Robert Tjian 和 Xavier Darzacq。后者比较陌生，但前者就是鼎鼎大名的钱泽南。
▲ Robert Tjian（左） 和 Xavier Darzacq（右）
钱泽南（1949 年生，现年 68 岁），亚裔美国生物学家，目前就职于加州伯克利分校。钱泽南 1971 年于加州伯克利拿到文学学士学位，1976 年于哈佛大学获得博士学位，随后在冷泉港实验室 James D.Watson 课题组进行 3 年博士后训练，于 1979 年返回加州伯克利，任生物化学系助理教授。1987 年入选 HHMI，担任研究员，2009~2016年曾出任 HHMI 主席。钱泽南以其在真核生物转录过程的研究而闻名。1978 年，钱泽南发现了来自于病毒的，第一个可以调控哺乳动物细胞基因表达的蛋白，即 SV40 大T抗原。SV40 大T抗原此前被认为在简单生物系统中对于调控基因表达发挥关键功能，而钱泽南揭示了这个激活蛋白在高等生物中同样存在。
何为有丝分裂书签？
回到文章，标题中提到了“mitotic bookmarking”，直译为“有丝分裂书签化”，也叫做 “基因书签（Gene bookmarking）”。把 DNA 比作一本写满文字的书，转录即阅读。试想一下，当你想要把书本从图书馆借回家，你需要进行的第一步操作就是关上书本。如果你希望下一次接着阅读，那么你可能需要插入书签。DNA 也是一样，在有丝分裂过程中，DNA 首先暂停转录，染色质变紧缩，绝大多数转录因子从染色体上剥离。
那么问题来了：有丝分裂后，一个细胞变成两个细胞。肝细胞复制后还是肝细胞，肺细胞复制后还是肺细胞，但是子代细胞如何重建原始的转录程序呢？子代肝细胞如何知道应该按照肝细胞的转录程序进行，而不是肺细胞的呢？
不对！我们一定遗漏了关键的信息。现在的场景并不是我们将一本书从图书馆转移到家，而是我把书本复印一本，我该如何阅读复印后的书本。书本之于基因组信息，关键的不同在于，书本是有页码的，现代中文书本约定俗成的阅读模式是：从前往后，从左往右；而基因表达不同，并不是从 1 号染色体到 22 号染色体再到性染色体，也不是从一端表达到另一端。
为了更加真实地模拟基因组信息，我们假定手里的这本书没有页码，而且每一页并不是从上一段阅读到下一段，但每一段里面的阅读顺序是从左到右，从上到下。每一段就好似一个基因。现在问题转变为：我已经知道手里的这本书该如何阅读，当我把这本书复印后，我该如何阅读复印后的书？
转录因子可能扮演着书签的作用。在原始细胞中，转录因子结合到特定的 DNA 区域，调控基因时空特异性的表达；而有丝分裂过程中，转录因子从 DNA 上剥离，复印后的书本丢失了书签信息，我们该如何阅读复印后的书呢？子细胞该如何重建转录程序呢？
谁说转录因子一定与DNA剥离？
其实，在此前，人们已经发现了在有丝分裂中，个别转录因子始终可以结合到有丝分裂的染色体上，这样可以保证在有丝分裂后，书签依然保留，因此可以按照完全相同的模式阅读复印文本。本文对这种现象进行了系统性探究，令我们目瞪口呆的是，在有丝分裂过程中，转录因子与染色体相互结合是一种常见的现象。
细胞系：小鼠胚胎肝细胞系 JM8.N4
转录因子：Sox2、Oct4、Esrrb、Klf4、Sp1、Foxo1、Foxo3a、Stat3、Hsf1
结果：除了 Stat3 和 Hsf1，其余都不从有丝分裂中的染色体剥离
为何前人极少报道？
为何作者一下检测到了 7 个转录因子与有丝分裂中的染色体结合，而此前确极少报道？这其中一定暗藏玄机。
最初，作者只是怀疑 Sox2 可能作为有丝分裂书签。毕竟 Sox2 等转录因子对于干细胞维持多能性如此重要。为了检测 Sox2 是否可以与有丝分裂中的染色体结合，首先，作者对不同细胞周期的细胞进行同步化处理，收集到 95% 纯度的分裂期细胞（M），此外还用未经过处理的异步化的细胞（asynchronous，A）、G2 期和 S 期细胞作为对照，检测 Sox2 与不同状态细胞中染色质的结合情况。
▲ Western Blot 结果显示，Sox2 出现在染色体相关的组分中
随后作者利用盐析法检测这种相互作用的强度。在特定盐浓度下，染色质中的转录因子可以克服其与 DNA 的结合力，从染色质中脱离。
盐析法检测 Sox2 与 Oct4 与 DNA 的结合强度。对于 Sox2，只有在高盐情况下，才能洗脱下来，说明这种结合强度很高；此外，M 组（同步细胞周期状态）的强度稍低于 A 组（不同步），同时说明相比于间期的染色质，Sox2 与有丝分裂中的染色质结合强度稍弱。Cyt 表示胞浆组分，Chr 表示染色质相关组分。
这就是全部么？当然不是！俗话说，眼见为实。作者采用稳定表达 H2B-GFP 的小鼠 ES 细胞，利用标准的甲醛固定方法，检测 Sox2 的免疫荧光。然而，让作者大跌眼镜：Sox2 从有丝分裂的染色质中剥离！
H2B 作为染色体的 marker，Sox2（红色荧光）根本就没有出现在有丝分裂中的染色体上好么！
拿到这个结果的时候，如果是我，心里凉了大半截！刚刚看到希望的小火苗，一下被一盆水浇灭了！怎么办呢？作者没有放弃：在稳定表达 H2B-GFP 的小鼠 ES 细胞中过表达Halo 标签的 Sox2，在活细胞状态下观察，惊人地发现：Halo-Sox2 基本都富集在有丝分裂的染色体上。
果然，在活细胞状态下，Sox2 富集在有丝分裂中的染色体上。倒吸一口气，还好没放弃！
当然，有人可能会质疑，第二次转入了 Halo-Sox2 质粒，可能是外源性的 Sox 表达增多，才会富集在有丝分裂中的染色体上，内源性的还很能说。那就做个内源性的呗！作者用 CRISPR/Cas9 系统在内源性 Sox2 基因位点前敲入了 Halo-Tag，随后挑了三个纯和表达 Sox2 的克隆（Halo-Sox2 KI），并确认标签对于 Sox2 的功能（维持干细胞多能性）没有影响。接着，跟上面一样，在活细胞情况下成像，确认Halo-Sox2 KI确实富集在有丝分裂的染色体上。
▲ 在内源性的 Sox2 前敲入 Halo，得到类似的结果
更进一步，作者用时间分辨率显微镜观察，发现在有丝分裂的各个时期，Sox2 都可以结合到染色质上。
▲ 时间分辨率显微镜观察转录因子与染色质结合情况
当然，可能又有人质疑：你观察到的红色荧光可能只是由于 Knock-in 导致的假象，并不是内源性 Sox2 的富集。作者用甲醛对 Halo-Sox2 KI 细胞进行甲醛固定，随后用标准的免疫荧光检测，如果 Halo-Tag 与 Sox2 有共定位，那么总该是内源性的 Sox2 了吧。
果然，结果是如此完美！无论对于过表达细胞还是 Halo-Sox2-KI 细胞，Halo 与 Sox2 都可以很好的共定位。然而，定睛一看，我惊呆了，Sox2 刚好完美地从染色质剥离。Sox2 为紫色荧光，但是唯独有染色质的区域，没有 Sox2！！！
为了更好地表征 Sox2 等转录因子结合到染色质上的效果，作者定义了染色质富集度 Chromosome Enrichment，Chr Enr=Log2(结合到染色质的平均光密度/总体细胞的平均光密度)，当结合到染色质的平均光密度/总体细胞的平均光密度=1，即转录因子富集到染色质上，越是大于 1，则富集程度越高；而比值小于 1，则说明转录因子从染色质上剥离。而对于 Chr Enr，大于 0 则表示富集，小于 0 则表示剥离。
▲ 作者新建立的表征方法很棒！很好地反应富集和剥离情况
利用 Chr Enr 指数，对刚才令我们大吃一惊的结果进行表征，发现经过甲醛处理后，原本富集的转录因子与染色质剥离了！
一个令我们惊喜不已，又细思极恐的结论浮出水面：标准的免疫荧光操作中的多聚甲醛固定，导致 Sox2 从有丝分裂中的染色质剥离！
这难道是在挑战过去几十年采用甲醛固定细胞做免疫荧光或者 ChIP 的文章吗？作者倒吸一口凉气！搞大新闻之前必须谨慎再谨慎：作者提到了 2003 年的一篇文献，当时报道了 HMGB 蛋白在甲醛固定后与有丝分裂染色质剥离的研究，但当时那篇文章作者解释道：可能是甲醛特异性地改变了 HMGB 蛋白的结构，进而导致了剥离，而 Sox2 也含有 HMG 结构域，因此可能也是同样的原因。援引此前模糊的结论，可能只是作者不想在否定过去几十年甲醛固定方法时显得语气太强硬而已。
甲醛固定真的有错么？
回顾此前多年人们对于转录因子的研究，尤其是那些认为转录因子会从染色质上剥离的研究，都是用甲醛在固定呀！！！作者想要搞清楚，甲醛固定真的是罪魁祸首么？
为此，类似于 Sox2，作者过表达了其他 8 个转录因子：Oct4、Esrrb、Klf4、Sp1、Foxo1、Foxo3a、Stat3 和 Hsf1，分别在活细胞和甲醛固定下进行定量分析，发现在所有的情况中，甲醛固定后，转录因子富集到染色质上的水平显著降低，导致所有的转录因子最终显示出与染色质剥离的结果。
▲ 诺，铁证如山！
当然，作者为了说明自己并没有在以一己之力挑战过去几十年的发表结果，还需要找一些帮手和对自己有利的证据。比如，2010 年，有人报道在鸡 DT40 细胞中，大量的转录因子可以结合到有丝分裂的染色质中。
此外，你或许会觉得上面 8 种转录因子中，下面一行的 4 个转录因子结果并不完美。Foxo1 和 Foxo3a 在活细胞情况下，基本不与染色质结合；而 Stat3 和 Hsf1，在活细胞情况下，甚至已经与染色质剥离！这怎么解释呢？原来呀，这两个转录因子在间期必须有外部信号将其转运到细胞核中才可以发挥作用。
甲醛固定使得转录因子与有丝分裂中的染色质剥离！这是一种通用的情况么？作者换了很多其他常用的固定方法，也换了很多融合标签。
▲ 化学固定在某种程度上，均可以使得转录因子从有丝分裂的染色质中剥离
实验技能 Get
不同状态细胞同步化处理：对于分裂中的细胞，用 100ng/ml 的Nocodazole（诺考达唑）处理 6 小时，随后摇晃下来；对于其他状态的细胞，加入终浓度为 2mM 的胸腺嘧啶脱氧核苷，孵育 6 小时，随后加入新鲜培养基孵育 6 小时，此为一个循环，连续处理两个循环，将处于 S 期的细胞收集起来，随后加入 100ng/ml 的 Nocodazole 处理 6 小时，将细胞振荡下来，而依然黏附的细胞收集起来，作为 G2 期细胞。
以上只是论文的【第一大部分】
小伙伴们先消化一下，明天继续扒！