遗传病基因治疗新突破｜健识药师谈

《健识药师谈》栏目第615期

通过腺相关病毒（AAV）递送CRISPR基因编辑工具，为开发永久性逆转致病基因缺陷的疗法提供了巨大潜力。通过这种方式来靶向并敲入正常基因序列以恢复基因功能，而不用管突变类型，因此是一种很有吸引力的基因治疗策略。

然而，想实现AAV-CRISPR有效在体内细胞中的基因敲入，通常需要递送高剂量AAV，这会带来潜在安全风险，而且大大增加生产成本。

近日，香港中文大学冯波团队在 Nature Communications 期刊发表了题为：Low-dose AAV-CRISPR-mediated liver-specific knock-in restored hemostasis in neonatal hemophilia B mice with subtle antibody response 的研究论文。

研究团队系统研究了AAV-CRISPR介导的体内NHEJ基因敲入，实现了有效且更低和更安全剂量的AAV剂量，在成年和新生小鼠血友病B型模型中实现了有效的人源F9基因敲入，恢复了凝血因子Ⅸ的表达，从而恢复了血友病B型小鼠的凝血功能。

值得一提的是，在接受低剂量AAV-CRISPR的新生小鼠中，抗Cas9和抗AAV的血浆抗体几乎可以忽略不计，这为AAV-CRISPR介导的体细胞基因敲入治疗遗传性疾病提供了支持。

由凝血因子Ⅸ（由F9基因表达）突变引起的遗传性血友病B型被广泛用作疾病模型来研究基因敲入。通过同源定向修复（HDR）机制，使用AAV递送的锌指核酸酶（ZFN）在小鼠体内敲入人F9基因外显子（hF9 Ex2-8），使用AAV递送的CRISPR-SaCas9敲入小鼠mF9 Ex2-8和高活性hF9 R338L变体。

除了同源定向修复（HDR），DNA的另一种修复机制非同源末端连接（NHEJ）最近也被用于基因敲入，与HDR相比，基于NHEJ的基因敲入效率更高。由于无需同源序列，在进行体内基因编辑时，通过AAV递送供体序列进行NHEJ基因敲入具有潜力更大，也更具灵活性。

迄今为止，通过基于HDR或NHEJ的策略，AAV递送的体内基因敲入的效果已在临床前模型中得到广泛证实。然而，有效的体内基因敲入大多是以高剂量AAV为代价的，这会显著增加潜在安全风险和生产成本。

在这项研究中，研究团队在mAlb基因的3'UTR区域的新靶点进行了AAV-CRISPR介导的不依赖于同源序列的基因敲入。单剂AAV成功在成年和新生血友病B型小鼠中实现了人源F9基因的长期整合和表达，产生了高水平的人凝血因子因子Ⅸ（hFⅨ），并在整个48周的观察期间稳定地恢复凝血功能。

此外，研究团队通过使用高活性hF9 R338L 变体的肝脏特异性基因敲入，以显著降低的AAV剂量恢复了血友病B型小鼠的凝血功能（新生小鼠剂量为2×10E9 vg，成年小鼠为1×10E10 vg）。

在接受低剂量AAV-CRISPR的新生小鼠中，抗Cas9和抗AAV的血浆抗体几乎可以忽略不计，这为AAV-CRISPR介导的体细胞基因敲入治疗遗传性疾病提供了支持。

论文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.ade1633

运营 | 贾赛轩

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