模式动物系列（二）——基因编辑鼠的构建

通过上一期的学习，我们已经知道，在生物医药行业，鼠是最常用的模式动物。特别是，近年来，随着基因编辑技术的飞速发展，利用基因修饰的大小鼠进行人类疾病的前沿研究也取得了重大的成果。

利用基因修饰小鼠作为人类疾病模型，一方面推动了对人类疾病分子机制和细胞信号转导的了解；此外，基因编辑技术的小鼠模型也为精确绘制个体病理基因表达谱提供了重要科研数据，这为今后的个体精准医疗奠定了重要基础。

首期介绍过的ES细胞基因打靶技术是获取基因编辑小鼠的传统方法，这一技术起源于上世纪80年代，1984年Bradly等实现了ES细胞以当时相对较高的概率发育为嵌合体小鼠的生殖细胞系。 

1987年，Thompsson等首次利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除的小鼠模型，此后这项技术获得了长足发展。然而，利用ES细胞基因打靶技术建立小鼠模型因操作繁琐复杂、耗时长、人力物力成本高，限制了这一技术的广泛应用。

但是，ZFN、TALEN以及CRISPR/Cas9等新兴基因编辑技术的出现和发展颠覆了遗传工程动物的构建方式，甚至有可能重新定义哪些物种可作为模式生物。

尤其是利用最新的CRISPR技术科学家现在可以在短短3-4周的时间内构建出携带单个甚至多个基因突变的小鼠，而采用传统的方法这需要数年的时间。并且CRISPR/Cas9具有操作简便，靶点选择范围广，作用活性高等优势。

 图1. CRISPR/Cas9介导的DNA双链断裂及基因编辑示意图

（Shao Y et al.Nature protocol,2014）

CRISPR/Cas9做为目前效率最好的基因编辑工具之一，我们这次就先来说说以利用CRISPR-Cas9是如何建立基因编辑小鼠模型的

实验步骤

1. 针对特定基因序列，利用软件（sgRNA Designer）预测潜在sgRNA序列，并依据实验要求挑选合适的靶点；

2. sgRNA活性筛选，选出有活性且特异性高的sgRNA；

3. 构建sgRNA表达载体，并利用T7体外转录试剂盒进行sgRNA体外转录；

4. 利用SP6转录试剂盒进行Cas9  mRNA体外转录；

5. 将Cas9 mRNA和sgRNA按合适浓度混匀，并进行受精卵显微注射；

6. 注射后的受精卵移植到假孕母鼠体内继续发育；

7. 待子代小鼠出生后对其进行基因型分析。

图2. 利用CRISPR/Cas9建立基因修饰小鼠模型

sgRNA设计与筛选

1. 选择sgRNA靶点时应挑选特异性高的序列，以避免off-target效应；

2. 将sgRNA oligo构建至px330载体上，同时构建含有目的基因靶序列的luciferase 表达载体上，二者共同转染293T细胞；

3. 转染6小时后补液，48小时后收集细胞，并加入裂解液裂解细胞；

4. 12,,000rpm离心5min，将上清液收集至洁净EP管中；

5. 按荧光素酶试剂盒进行操作并检测。

F0代小鼠基因型鉴定

1. 取出生后5—7天小鼠组织，消化并提取基因组后进行PCR，扩增目的条带；

2. 将PCR产物进行梯度降温退火处理，加T7E1酶并在37℃水浴酶切30min；

3. 琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物是否能被切割为多条片段；

4. 送测序分析，并保留符合要求的突变小鼠；

5. 待小鼠具有生殖能力后进行交配，以获得足够数量的杂合及纯合小鼠。

52 28667 52 14942 0 0 2180 0 0:00:13 0:00:06 0:00:07 2953

注意事项：

1. 体外转录的Cas9 mRNA和sgRNA要求纯度高，且在操作过程中防止RNA降解；

2. 显微注射胚胎要保证状态良好，且数量充足；

作为协助及提供科研解决方案的生命科学实验室，邦耀实验室基于基因编辑技术平台，已经成熟掌握利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除、基因敲入及条件性敲除的大小鼠，可以高效靶向的构建模式动物。

参考文献：

1. Bradley A, Evans M, Kaufman MH et al.Formation of germ-linechimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.Nature.1984.17-23;309(5965):255-6.

2. Doetschman T, Gregg RG et al.Targettedcorrection of a mutant HPRT gene in mouse embryonic stem cells.Nature. 1987,10-16;330(6148):576-8.
   

3. Li D, Qiu Z,Shao Y et al. Heritablegene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system.Natbiotechnol.2013;31(8):681-3.

4. Shao Y, Guan Y, Wang L et al. CRISPR/Cas-mediatedgenome editing in the rat via direct injection of one-cell embryos.Natprotoc.2014;9(10):2493-512

5. Yang H, Wang H et al.One-stepgeneration of mice carrying reporter and conditional alleles byCRISPR/Cas-mediated genome.Cell.2013; 154(6):1370-9.