韩国首尔大学​Nano-Micro Letters：纳米颗粒介导肿瘤微环境中T细胞脂质代谢重编程用于免疫代谢治疗

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肿瘤的异质性限制了抗肿瘤纳米药物的临床转化。为了规避肿瘤细胞的异质性，可以利用肿瘤微环境中与肿瘤相邻的异质性较小的免疫细胞来实现肿瘤的治疗。目前在肿瘤微环境中报道的靶点包括：癌相关成纤维细胞上表达的成纤维细胞活化蛋白；树突状细胞表达的CD11c以及T细胞的生物标记物CD3。此外，肿瘤微环境中缺乏葡萄糖在，T细胞的细胞活性因能量不足而受损。因此，对肿瘤微环境中的免疫细胞进行代谢重组，使其可以利用不同的能量底物，将是改善免疫治疗的可行性策略。

Nanoparticle-Mediated Lipid Metabolic Reprogramming of T Cells in Tumor Microenvironments for Immunometabolic Therapy

Dongyoon Kim, Yina Wu,Qiaoyun Li, Yu‑Kyoung Oh*

Nano-Micro Letters (2021)13:31

本文亮点

1. aCD3/F/AN，抗CD3e f(ab′)2片段修饰两亲性聚谷氨酸，并将非诺贝特封装在两亲性聚谷氨酸纳米颗粒中，可以实现T细胞重编程的线粒体脂质代谢。

2. aCD3/F/AN在葡萄糖缺乏条件下特异性激活T细胞，对肿瘤细胞产生效应杀伤作用。

3. 体内用aCD3/F/AN治疗可增加T细胞浸润、细胞因子产生，并阻止肿瘤生长。

内容简介

韩国首尔大学Yu‑Kyoung Oh教授等在这项研究中报导了通过纳米颗粒诱导的脂质代谢重编程来激活T细胞的抗癌活性。将脂质代谢激活药物分子(非诺贝特)包裹在两亲性聚谷氨酸纳米粒(F/ANs)中，用抗CD3ef(ab′)2片段修饰F/ANs表面来实现T细胞的靶向输送，得到靶向T细胞的aCD3/F/ANs纳米颗粒。非诺贝特可以诱导过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-α)的表达，同时其下游脂肪酸代谢相关基因的表达也可以被非诺贝特激活。据报道，口服PPAR-α激动剂可促进脂肪酸代谢，缓解肿瘤微环境中低血糖引起的代谢应激，保护T细胞的功能，从而增强抗PD-1免疫治疗作用。体外研究显示，aCD3/F/ANs激活脂肪酸代谢和线粒体功能，刺激肿瘤微环境中T细胞的抗癌活性；同时，在aCD3/F/ANs处理的T细胞中，PPAR-α和下游的脂肪酸代谢相关基因的表达有显著提高。用aCD3/F/ANs治疗荷瘤小鼠可促进肿瘤组织中多种细胞因子的产生并阻止肿瘤生长。研究结果表明，纳米技术使T细胞的脂质代谢重新编程具有成为一种新的免疫代谢疗法的潜力。

图文导读

I aCD3/F/AN的表征

通过碳二亚胺交联反应将苯丙氨酸乙酯与聚(γ-谷氨酸)(γ-PGA)接枝来合成两亲性聚(γ-谷氨酸)(AP)。并采用薄膜水化法将非诺贝特封装在基于AP的纳米颗粒(ANd)或基于fAP的纳米颗粒(fAN)中。并对aCD3/F/ANs的形态，大小和表面电荷的理化性质进行了表征。

图1. aCD3/F/ANs对T细胞的代谢重编程示意图。a. aCD3/F/ANs制备过程的示意图。b. aCD3/F/ANs促进T细胞线粒体脂肪酸代谢的机制。c. 脂肪酸代谢重编程对T细胞介导的癌细胞杀伤的影响。

图2. 纳米粒子的表征。a. ANs、ACD3/ANs、F/ANs和ACD3/F/ANs的示意图。b. 用透射电镜观察aCD3/F/ANs的形态。比例尺：200nm。c. 用DLS测定的不同纳米粒子的平均粒径。d. 用激光多普勒微电泳法测定纳米颗粒的Zeta电位。e. 通过STEM-EDS对aCD3/F/ANs的氧、氯和硫元素进行表征。比例尺：200 nm。f. 通过HPLC定量纳米粒中包裹非诺贝特的量。g. PBS中F/ANs和aCD3/F/ANs的粒径，监测7天。h. aCD3/F/ANs中非诺贝特的释放，在不同pH条件下通过HPLC定量(***P<0.001)。

II aCD3/F/Ans的T细胞摄取研究

使用荧光染料标记的纳米颗粒，通过共聚焦显微镜和流式细胞术监测T细胞对aCD3/F/ANs的摄取。aCD3/F/fANs的细胞摄取效率较F/fANs以及抗CD3抗体和fANs的混合物高。使用aCD3/F/fANs治疗后，荧光阳性T细胞数量最高，比其他治疗组高3.8倍。

图3. T细胞摄取纳米颗粒。小鼠脾源性T细胞与各种含非诺贝特的纳米颗粒制剂一起培养。24小时后，通过共聚焦显微镜观察(a)纳米颗粒的细胞摄取，并通过流式细胞仪(b、c)定量(***P<0.001，n.s.，不显著)。比例尺：10μm。

III aCD3/F/ANs对T细胞脂肪酸代谢相关基因表达和脂质摄取的影响

用aCD3/F/ANs处理T细胞影响脂肪酸氧化相关基因表达水平和脂质摄取。为了定量评估代谢重编程，用流式细胞仪检测PPARα在T细胞上的表达水平。在用aCD3/F/ANs处理的T细胞中，在蛋白质水平和mRNA水平上PPARα的表达最高。aCD3/F/ANs治疗组的PPARα阳性T细胞数量较未治疗组增加了7.2倍以上。此外，流式细胞术检测细胞膜上脂肪酸转位酶CD36的表达水平。aCD3/F/AN组的CD36表达较F/AN组高2.2倍。Western-blot结果显示，aCD3/F/Ans和其它组相比，显著提高了CPT1B、LCAD和MCAD的蛋白表达水平。与未处理细胞相比，CPT1B、LCAD和MCAD的mRNA水平分别增加了4.4倍、2.5倍和2.8倍。由于观察到的基因表达变化的一个结果是脂质摄取率增加，我们使用荧光染料标记的脂质BODIPYC16来测量T细胞的脂质摄取。与未经处理的细胞相比，经ANs、aCD3/ANs、F/AN或抗CD3抗体和F/ANs混合物(aCD3+F/ANs)处理的T细胞在T细胞的脂质摄取方面没有明显变化。相反，与未处理的T细胞相比，用aCD3/F/ANs处理T细胞可使脂质摄取增加3.1倍。

图4. T细胞脂肪酸代谢相关基因表达和脂质摄取。a. aCD3/F/AN诱导的脂质代谢增强的细胞机制示意图。左半部分表示未经治疗的情况，右半部分表示用aCD3/F/ANs进行治疗。采用aCD3/F/AN处理激活T细胞中的PPARα，导致脂肪酸代谢相关蛋白的过度表达，包括CD36(脂肪酸转位酶)、CPT1B、LCAD和MCAD。线粒体脂肪酸代谢的增加通过TCA循环产生更高的能量。b. 流式细胞仪测定T细胞中PPARα的相应水平(PPARα+/ CD3+)。c. 流式细胞仪检测T细胞中CD36蛋白的水平(CD36+/CD3+)。d. westernblot检测T细胞CPT1B、LCAD和MCAD蛋白表达水平。e, f. 用荧光脂质体BODIPY C₁₆孵育经不同纳米粒子处理的T细胞，流式细胞仪(e)测定荧光脂质与T细胞的结合，并用平均荧光强度(f)表示(***P<0.001)。g. RT-PCR检测脂肪酸代谢相关基因、CPT1B、LCAD和MCAD的mRNA表达水平(***P<0.001)。

IV aCD3/F/ANs激活T细胞线粒体

aCD3/F/ANs可调节T细胞的线粒体功能，包括脂肪酸代谢。与高糖条件下的T细胞线粒体相比，未经处理的T细胞或经纳米颗粒(如AN、aCD3/AN和F/AN)处理的T细胞显示出界限不清的线粒体嵴，形态缩小。与此相反，aCD3/F/ANs处理的T细胞显示线粒体结构，嵴清晰，与高糖环境下观察到的相似。aCD3/F/Ans还可以提高线粒体的膜电势。aCD3/F/AN介导的非诺贝特对T细胞的传递增强了脂质代谢和线粒体活性。

图5. T细胞线粒体形态、膜电位和脂肪酸代谢。在添加棕榈酸作为脂质来源的低葡萄糖培养基中用aCD3/F/ANs处理T细胞。a. 透射电镜显示T细胞在高糖培养基、未经aCD3/F/AN处理或经aCD3/F/AN处理的低糖培养基中的线粒体。比例尺：1μm(上面板)和500 nm(下面板)。b. 线粒体膜电位，用MitoTracker橙色CMTMRos评估，共焦荧光显微镜观察。c. 线粒体膜电位增加的T细胞群，通过流式细胞术定量。d, e. 使用Seahorse XFp分析仪测量ECAR(d)和OCR(e)。f-h. 根据ECAR和OCR值获得的Basal OCR(f)、SRC(g)和OCR/ECAR (h)值(*P<0.05，**P<0.01)。i. β‑羟丁酸分泌水平(***P<0.001)。

V 代谢重编程T细胞的体外增殖

aCD3/F/ANs处理对T细胞的存活和增殖的影响。在葡萄糖缺乏但富含棕榈酸盐的环境中，与其他治疗组相比，aCD3/F/AN治疗组的活T细胞比例最高，膜联蛋白V–/PI–细胞群显著高于其他治疗组。此外，补充棕榈酸酯后，aCD3/F/AN处理的T细胞增殖比未处理组高5.4倍。

图6. 代谢重编程诱导的T细胞存活和增殖增强。T细胞被激活并用各种纳米颗粒制剂处理，并在葡萄糖限制条件下培养，无论是否有脂质来源。a. 实验方案说明。b. 活的和死的T细胞，通过荧光染色显示。比例尺：10μm。c, d. 用annexin V和PI染色T细胞，并对各组annexin V–/PI–群体进行定量(***P<0.001)。e. 使用WST‑1分析法测量T细胞的增殖(***P<0.001)。

VI aCD3/F/AN处理的T细胞的体外癌细胞杀伤活性

aCD3/F/ANs治疗增强了T细胞对癌细胞的杀伤活性。T细胞与B16F10黑色素瘤细胞共孵育后，aCD3/F/AN处理T细胞组的颗粒酶B和IFN-γ的水平分别比F/AN处理组高2.3倍和3.0倍。用aCD3/F/AN处理的T细胞孵育后死亡癌细胞的数量是用aCD3和F/Ans混合处理的的15.6倍。

图7. aCD3/F/AN处理T细胞的体外抗癌活性。用不同的纳米颗粒制剂处理T细胞，并与B16F10细胞在葡萄糖限制条件下在棕榈酸酯作为脂质源存在下共同培养。a. 实验方案说明。b, c. granzyme B (b)和IFN‑γ(c)阳性T细胞的细胞流式数据。d, e. granzyme B (d)和IFN‑γ(e)阳性T细胞群落含量。(***P<0.001)。f. 死亡癌细胞含量，流式细胞术定量(***P<0.001)。g. 实时记录通过T细胞溶解癌细胞。癌细胞用红色荧光染料标记，而T细胞用绿色荧光染料标记。

VII aCD3/F/ANs在肿瘤组织中T细胞的分布

通过在荧光图像中与T细胞的共定位，可以观察到纳米颗粒在肿瘤组织中T细胞的体内分布。与F/fANs和aCD3+F/AN组相比，aCD3/F/fANs在肿瘤组织中的滞留率最高。在aCD3/F/fANs治疗组中，给药后72小时内纳米颗粒在肿瘤组织中的分布最高。纳米颗粒与CD3+T细胞的共定位在aCD3/F/fAN治疗组中最高，在24小时时表现出比F/fAN组大7.6倍。肿瘤组织染色显示aCD3/F/fANs与肿瘤内CD3+T细胞有较高的共定位。

图8. aCD3/F/ANs的体内T细胞靶向能力。通过向小鼠(n=3)瘤内注射含有非诺贝特的各种纳米颗粒制剂来评估T细胞靶向能力。a. 不同时间点的肿瘤部位的体内荧光。b. 不同时间点肿瘤部位荧光定量(**P<0.01，***P<0.001)。c. 通过流式细胞术分析肿瘤驻留T细胞中纳米粒的摄取。d. 每个治疗组定量CD3+FITC+T细胞量，(***P<0.001)。e. 共焦显微镜观察纳米颗粒(绿色)与CD3+T细胞(红色)共定位。比例尺：20μm。

VIII aCD3/F/AN处理T细胞体内脂肪酸代谢的重编程

肿瘤内注射aCD3/F/Ans可以通过T细胞调控体内的PPARα的表达、脂质摄取和代谢。流式细胞仪检测PPARα‑阳性和BODIPY C₁₆阳性。aCD3/F/AN治疗组的T细胞数量增加的幅度更大。aCD3/F/AN治疗组的T细胞数量增加的幅度更大。与F/AN和aCD3+F/AN治疗组相比，aCD3/F/AN治疗组PPARα的表达分别增加了4.1倍和2.6倍。aCD3/F/AN治疗组的BODIPY C₁₆脂质摄取几乎是其他组的两倍。与未治疗组相比，aCD3/F/AN治疗组小鼠CPT1B、LCAD和MCAD的蛋白表达和mRNA水平显著增加。免疫组化显示在肿瘤组织中CD3+T细胞中不同的PPARα表达。MALDI成像显示用aCD3/F/ANs处理的T细胞，其脂肪酸氧化代谢产物乙酰乙酸，β‑羟丁酸和棕榈酰肉碱有所增强。

图9. 体内肿瘤组织中T细胞的PPARα表达和脂质吸收。a. B16F10荷瘤小鼠在肿瘤接种后第10天和第12天瘤内注射各种纳米颗粒制剂。第13天，瘤内注射BODIPY C16，第14天，提取并分析肿瘤组织。b-e. 通过流式细胞术分析T细胞(b，d)和BODIPY C16阳性CD3 T细胞(c，e)的PPARα表达水平(***P<0.001)。f. westernblot检测肿瘤浸润T细胞CPT1B、LCAD和MCAD蛋白表达水平。g. 通过RT-PCR(***P<0.001)测定肿瘤浸润T细胞中脂肪酸代谢相关基因CPT1B、LCAD和MCAD的mRNA表达水平。h, i. 未治疗组(h)和aCD3/F/AN治疗组(i)的肿瘤组织的共聚焦显微镜图像用抗CD3(绿色)和抗PPAR进行免疫染色α (红色)抗体和DAPI复染。比例尺：100μm。j. β‑MALDI成像显示乙酰乙酸(m/z=103.09)，羟丁酸(m/z=105.10)和棕榈糖基肉碱(m/z=400.60)的肿瘤组织分布。比例尺：5 μm。

IX 代谢重编程T细胞的体内抗肿瘤作用

为评价aCD3/F/ANs对小鼠肿瘤生长和存活的影响，我们在B16F10荷瘤小鼠瘤内注射两次，接种后第10天注射一次，第12天再次注射不同的纳米颗粒制剂。结果显示，aCD3/F/AN治疗的肿瘤生长抑制效果显著高于其他纳米颗粒制剂。为了验证观察到的抗肿瘤疗效是否归因于代谢重编程T细胞的功能增强，我们对肿瘤浸润性CD8+T细胞进行了定量。结果显示，在用aCD3/F/ANs治疗的小鼠中，肿瘤组织中的CD8+T细胞数量显著增加，肿瘤组织中的CD8+T细胞数量是F/AN治疗组小鼠的14.8倍。aCD3/F/ANs的体内治疗影响IFN-α的表达水平γ T细胞颗粒酶B。aCD3/F/AN治疗组中表达的干扰素-γ肿瘤T细胞占20.5%±4.1%，比F/AN和aCD3+F/AN治疗组增加了5倍以上。与干扰素γ的表达模式类似， aCD3/F/ANs组表达granzyme B的T细胞百分比最高，比其他治疗组表达水平增加了3.9倍以上。对肿瘤组织的免疫组化分析显示，未治疗小鼠的肿瘤组织中没有明显的CD8+T细胞浸润。然而，在用aCD3/F/ANs治疗组的肿瘤组织中可以观察到有大量CD8+T细胞浸润和IFN-γ和颗粒酶B的分泌。

图10. aCD3/F/ANs的体内抗肿瘤作用。a. B16F10荷瘤小鼠在肿瘤接种后第10天和第12天瘤内注射不同的纳米颗粒制剂。b, c. 通过测量肿瘤体积来确定抗肿瘤疗效。d.各组小鼠存活率，肿瘤接种后60天监测。

图11. T细胞在肿瘤组织中产生细胞因子。a. B16F10荷瘤小鼠在肿瘤接种后第10天和第12天注射纳米颗粒制剂。第14天，提取肿瘤组织进行分析。b-d. 流式细胞术检测浸润性CD8+T细胞(b)，肿瘤组织CD3+T细胞中表达干扰素-γ的T细胞(c)和颗粒酶B的T细胞(d)(**P<0.001)。CD3+/CD8+细胞群(e)，CD3+/IFN‑γ+细胞(f)和CD3+/颗粒酶+细胞(g)。h, i. 在未治疗(h)和aCD3/F/AN治疗(i)的小鼠中，提取肿瘤组织并用抗CD8(黄色)、抗IFN-γ进行免疫染色(绿色)和抗颗粒酶B(浅紫色)抗体，并用DAPI复染。比例尺：20μm。

原文链接
https://doi.org/10.1007/s40820-020-00555-6

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