广西师范大学赵书林教授课题组《ACS AMI》：吸收红移碳点用于肿瘤组织pH的双光子荧光成像及协同光疗

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光疗是一种新型的肿瘤治疗方法。光动力疗法(PDT)的基本原理是光敏剂经激光照射产生光动力学反应，生成具有杀伤细胞作用的单线态氧或其他自由基等细胞毒性物质，杀伤增殖活跃的细胞，达到治疗目的。然而，缺氧是肿瘤微环境的主要特征之一，这严重限制了PDT的治疗效果。光热疗法(PTT)的基本原理是光热材料吸收近红外光的光能，并将其转化为热能，从而有效地杀灭癌细胞。近年来，双功能光疗纳米治疗剂在癌症治疗中引起了人们的关注，双功能光疗比单一光疗具有更好的协同治疗效果。然而，已报道的双功能光疗纳米治疗剂大多是由两个或两个以上结构复杂、合成路线繁琐的功能单体整合而成。因此，单组分双光疗纳米治疗剂的开发仍然是人们值得期待的研究工作。另一方面，以两个近红外光子为激发源的双光子(TP)荧光成像具有穿透深度大、组织自发荧光背景小、对生物组织损伤小等优点，近红外TP荧光成像在生物医学研究和临床诊断中显示出广阔的应用前景。

近日，广西师范大学赵书林教授团队在《ACS Applied Materials & Interfaces》期刊上发表了题为“Carbon Dots with Absorption Red-Shifting for Two-Photon Fluorescence Imaging of Tumor Tissue pH and Synergistic Phototherapy”的文章。该项研究以赖氨酸，邻苯二胺和硫酸为原料，通过一锅水热合成制备得到S, N元素共掺杂的碳点（S,N-CDs), 用于肿瘤组织pH的TP荧光成像及PDT/PTT协同光疗。S,N-CDs的制备过程与应用原理如下图所示：

该研究同时合成了CDs, N-CDs和S,N-CDs, 通过对它们的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱比较, 发现采用S, N元素共掺杂合成的碳点相比N掺杂合成的碳点，吸收红移了200 nm。与CDs相比，它们的荧光发射峰也红移到570和630 nm。这种吸收红移特征，不仅提高了单线态氧阐释效率，而且使其光热转换效率也大大提高（高达34.4%）。从而实现了增强的光动力学和光热协同治疗效果。

图1. CDs、N-CDs和S,N-CDs的紫外吸收光谱（A）和荧光光谱（B）。在激光照射5 min和CDs、N-CDs及S,N-CDs存在的条件下，DPBF的吸收光谱（C）和顺磁共振波谱仪（D）。PBS、CDs、N-CDs和S,N-CDs溶液（100 μg/mL）在激光照射下，不同时间点的温度热成像图（E）和温度变化曲线图（F）。

 在磷酸盐缓冲溶液中, 通过单光子激发检测了S,N-CDs对pH的响应。 结果表明, S,N-CDs的荧光强度随着溶液pH的增加而降低。在pH为4.0−8.0时，荧光强度和pH值具有良好的线性关系，溶液的颜色从浅绿色变为橙色。同时，通过对合成的CDs、N-CDs和S,N-CDs的TP荧光光谱分析，我们发现N-CDs在808 nm 激光激发时有一个发射峰，而CDs 没有明显的发射峰，表明CDs没有TP荧光发射能力。然而，S,N-CDs不仅在625 nm处有显著的TP发射峰，而且对不同的pH值表现出特异性和敏感的响应。S,N-CDs的这一特征提供了采用TP荧光监测溶酶体pH值的可能性。

图2. (A)不同pH值溶液中S,N-CDs的荧光光谱。(B) S,N-CDs的荧光强度与溶液pH值的线性相关性 (λex=570 nm)。(C) S,N-CDs、N-CDs和CDs的TP发射光谱(λex=808 nm)。(D)不同pH值下，S,N-CDs的TP发射光谱(λex= 808 nm)。

在不同pH值溶液中，采用S,N-CDs孵育HeLa细胞后进行TP荧光成像。结果发现pH值从4.0增加到8.0时，红色荧光逐渐减弱。在肿瘤PDT/PTT治疗过程中，由于溶酶体的损伤导致其酸性物质释放到细胞质中，随着pH值的不断升高， S,N-CDs的TP荧光强度逐渐降低。从而实现了协同光疗过程中细胞凋亡的实时监测。

图3. 在不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0）下，S,N-CDs在HeLa细胞中的TP荧光成像(A)和TP荧光强度（B）。利用S,N-CDs的TP荧光成像监测光疗过程中细胞内溶酶体pH的变化. 细胞内溶酶体的TP荧光成像(C)和荧光强度(D)（λ_ex=840 nm，λ_em=580−680 nm）。

在正常的生理pH条件下，S,N-CDs的TP荧光几乎看不见。当S,N-CDs进入肿瘤微环境时，TP荧光信号显着提高，并且当它到达细胞内溶酶体时，可以产生清晰的TP荧光信号。因此，S,N-CDs表面官能团的质子化和去质子化过程，实现了肿瘤组织pH值的TP荧光成像。

图4. 肿瘤组织与正常肌肉组织在单光子（552 nm）和双光子（840 nm）激发下的荧光成像（A）和荧光强度（B）。  

基于S,N-CDs纳米粒子在体外的PTT/PDT协同效应，通过携带肿瘤的裸鼠模型皮下注射S,N-CDs，研究了S,N-CDs纳米粒子在体内的光治疗作用。研究结果表明，合成的S,N-CDs是一种有效的PTT/PDT协同光疗剂。该研究为碳基纳米药物的合成、协同光疗和准确诊断肿瘤提供了新的见解。

图5. 体内抗肿瘤实验。荷瘤裸鼠肿瘤组织（左）与正常肌肉组织（右）的荧光成像图（A）。荷瘤裸鼠的红外热成像图（B）。激光照射下不同荷瘤裸鼠组肿瘤组织的温度变化曲线（C）。各组荷瘤裸鼠治疗16天后，肿瘤组织解剖照片（D）。各组裸鼠治疗过程中的肿瘤体积变化（E）和体重变化（F），以及治疗期间不同时间点的裸鼠照片（G）。治疗后16天后，从裸鼠身上解剖出的主要器官组织的H&E染色图（H）；治疗16天后，对肿瘤组织进行H&E染色、Ki-67免疫染色和TUNEL免疫荧光分析图（I）。

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https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsami.1c08076

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