国家纳米科学中心王浩研究员课题组《Adv. Mater.》：在体内自组装纳米药物领域的最新研究进展

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受体蛋白的寡聚化对于细胞功能发挥至关重要，是决定细胞命运的关键事件。膜受体蛋白寡聚化与下游信号网络和各种疾病病理密切相关。不同类别的各种细胞膜受体均可以聚集形成多受体复合物，从而触发许多生物学功能，例如用于免疫识别的T细胞受体，用于趋化性的甲基受体趋化蛋白等。激动剂需要诱导信号传导所需的共刺激受体的更高级寡聚化（超聚集）。这些二聚体或寡聚体复合物以惊人的高灵敏度控制细胞反应。除了需要考虑受体结合表位和亲和力等指标还需要考虑多重因素。相较于拮抗剂而言，激动剂的设计性和临床功效的研究相对较少。因此，对于膜受体寡聚化激动剂的开发亟需发展通用型的分子理念及表征手段。 近日Advanced Material杂志在线发表了国家纳米科学中心王浩课题组在体内自组装纳米药物领域的研究进展“Polyvalent peptide CD40 nano-agonist for targeted modulation of dendritic cells and amplified cancer immunotherapy”。该工作提出了一种全新的肿瘤免疫靶向治疗激动剂药物，展现出良好的临床转化前景。

 近年来，随着肿瘤免疫治疗的火热，大量研究也证实CD40-CD40L在免疫反应中对CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTL）功能起着至关重要的作用，是适应性免疫应答所必需的。据此进行CD40激动剂的研究，用于抗肿瘤治疗，成为当下一个研究热点。CD40（也称TNFRSF5，肿瘤坏死因子受体超家族成员5）是一种45-50kDa的I型糖蛋白膜受体，是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族蛋白的成员，CD40广泛表达于抗原呈递细胞（APC）。CD40信号的传导需要CD40天然配体连接CD40受体诱导形成空间上明确的三聚体信号复合物，由此产生的受体簇是信号传递到细胞的前提。
这个靶点药物设计的最大挑战是有效激活CD40，需要激动剂分子具有明确的聚集态空间结构，并且与受体蛋白分子精准适配。可控的分子组装体动态调控机制为激动剂设计提供了全新的思路。
自然界的一切生命以及相关功能都是分子通过多重弱相互作用协同，以非常精密、准确和程序化可控的方式自组装而实现的，并能够实现对多种刺激的响应，实现复杂的功能。超分子自组装生物功能材料的合理分子设计利用了强大而通用的非共价相互作用，提供了许多优势，如响应性、可逆性、可调谐性、仿生学、模块化、可预测性，以及最重要的适应性。因此，超分子自组装生物功能材料将有助于新疗法的发展，最终将导致下一代医学生物材料开发的范式转变。
正如诺贝尔得主Jean-Marie Lehn所预言“复杂功能超分子体系的研究是分子自组装未来研究的目标之一。自组装的研究只有从单一体系发展到多元体系、从单一层次发展到多层次、从静态发展到动态、从不可控发展到可控、从模型体系发展到功能材料，才能推动源头创新，实现自组装研究的突破性发展。”国家纳米科学中心王浩课题组一直致力于发展体内原位自组装的新型生物纳米材料，在生命体的组装过程和机制方面进行了系统研究，并探索了其在肿瘤成像和治疗方面的应用。 
图1 原位组装形成多聚体作为DC激动剂，实现了与受体分子多价高亲和力结合，主动诱导受体寡聚化，长效特异性激活DC细胞。

该研究，报道了一种具有界面拓扑结构的CD40多肽纳米激动剂(PVA-CD40)，实现受体的高效结合和受体寡聚化，可以有效和持久地激活淋巴结DC细胞，实现放大的免疫治疗效果。CD40 “锚定臂”多肽首先靶向结合到DC细胞膜上的CD40受体，其次“组装驱动马达”多肽通过Click反应与“锚定臂”多肽偶联合成PVA-CD40并快速地组装成超分子结构，形成空间明确的寡聚体信号复合物，并激活下游信号。此外，PVA-CD40超分子网络结构可保留在引流淋巴结(DLN)中，持续刺激DCs启动长期免疫反应。因此，PVA-CD40实现了体内持久的抗肿瘤免疫反应。

本文要点

1.通用的分子工具箱
PVA-CD40是由CD40“锚定臂”和“组装驱动马达”两个功能肽在DC细胞膜上原位制备，其原理是CD40 “锚定臂”多肽首先靶向结合到DC细胞膜上的CD40受体，其次“组装驱动马达”多肽通过Click反应与“锚定臂”多肽偶联同时激活自组装过程，原位形成具有界面拓扑结构的组装体。溶液中的研究结果表明，当两个功能多肽通过Click反应偶联后，分子的疏水结构域增加，同时分子构象由无规卷曲转变为β-折叠构象，共同驱动组装过程（图2）。
研究人员在前期工作中发展了“组装驱动马达”多肽，该多肽折叠成类似“三明治”的稳定结构，当偶联反应发生时折叠结构打开，暴露出组装多肽序列，从而激活自组装过程（Nat. Commun., 2019, 10(1), 4861；Exploration., 2021, 1:20210153）。对于“锚定臂”多肽可以根据目标靶点进行灵活更换（Adv. Mater., 2019, 31(11): 1807175； ACS Appl. Mater. Inter., 2020, 12, 40042）。因此，该分子设计为蛋白受体调控建立了一个普适性的分子工具箱。 
图2 受体蛋白介导的PVA-CD40多肽组装形成多键合位点的纳米结构 2.分子特异性组装增强与CD40受体的结合力
由于体内自组装的动态性和复杂性，自组装环境的组成可能会对单体的自组装行为产生影响。因此，为了揭示CD40蛋白在PVA-CD40自组装过程中的作用，研究人员通过ThT实验测试了PVA-CD40的组装动力学并计算了一些重要组装动力学参数，包括延迟时间(t_lag)和半数组装完成时间(t_1/2)。结果表明（图3），与游离PVA-CD40相比，在组装溶液中引入CD40蛋白后，t_lag由25.5 h缩短至5.4 h，t_1/2从34.5 h降低到8.5 h。这些结果说明CD40蛋白通过影响组装过程中的微观事件来加速肽的自组装过程。
同时，研究人员监测了在CD40蛋白存在和不存在的情况下PVA-CD40的二级结构转换。在CD40受体蛋白存在的情况下，PVA-CD40的构象在24 h转化为β- sheet构象。而未加入CD40蛋白的PVA-CD40的构象保持无规卷曲状态，说明在组装环境中引入CD40蛋白有利于PVA-CD40的构象转化，这也有助于加速PVA-CD40的自组装过程。此外，研究人员在TEM图像中观察到24 h后组装有序的蛋白-肽复合体网络结构。这些结果表明，蛋白-肽复合物的特异性结合和形成有利于PVA-CD40的自组装。 
图3 分子特异性组装增强与CD40受体的结合力
 3. 细胞膜分子原位组装表征的新技术
为了揭示PVA-CD40在细胞环境中的自组装特性，研究人员通过疏水敏感荧光探针NBD研究了PVA-CD40在树突状细胞表面的自组装过程。将NBD标记的AAP (100 μM)与DC2.4细胞孵育1 h，然后与等摩尔ADP处理，通过CLSM成像直接观察NBD荧光的变化。因此PVA-CD40处理后的DC2.4细胞在细胞膜上NBD荧光发射呈时间依赖性增加。ADP孵卵15 min后，研究人员观察到DC2.4细胞膜上出现弥散的荧光信号，30 min时出现少量的小簇，簇的数量和大小随着孵卵时间的延长而增加，这进一步表明PVA-CD40的快速自组装。通过NBD荧光变化的时间依赖性，获得了DC2.4细胞存在和缺失情况下PVA-CD40的自组装动力学曲线。在DC2.4细胞存在下，NBD标记的PVA-CD40的荧光强度急剧增加，并在2 h达到平台信号，而在未加DC2.4细胞的PVA-CD40的荧光强度并没有明显变化。此外，利用扫描电镜观察DC2.4细胞膜上PVA-CD40的超分子组装结构。研究人员观察到PVA-CD40处理后的DC2.4细胞膜上形成了一个有序的网络组装结构。以上结果表明，PVA-CD40在动态生理环境下比水溶液具有更快的组装过程，这可能进一步促进了受体的有效寡聚和下游信号的激活。 图4 PVA-CD40在细胞膜上的组装行为 4.动态调控受体寡聚化
荧光共振能量转移(FRET)方法被认为是研究受体寡聚化的标准方法。为了验证和可视化PVA-CD40诱导受体寡聚,研究人员利用FRET研究蛋白质之间相互作用。首先通过质粒转染构建了增强蓝色荧光蛋白(eBFP)和增强绿色荧光蛋白(eGFP)编码的CD40受体表达的DC2.4细胞。PVA-CD40处理组的FRET信号较AAP、ADP处理组明显增强。这种标记CD40受体之间增强的供体/受体的分子间FRET证实了纤维网状的PVA-CD40可以激活受体的寡聚化。Net FRET是表征FRET效能的参数，也间接揭示了细胞表面受体的寡聚程度。计算结果显示，PVA-CD40处理组的FRET的效果比ADP和AAP组分别提高了2倍和1.67倍。以上结果表明PVA-CD40能够较有效地诱导受体寡聚化。
通过CD40信号通路激活DCs，导致主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子上调，共刺激分子CD80、CD86表达增加，促炎细胞因子IL-12、TNF-α分泌增加。这些DC源性反应协同完成增强的抗原呈递和T细胞活化，这对启动所需的免疫反应至关重要。因此，为了证明PVA-CD40在CD40信号通路激活和树突状细胞成熟中的作用，研究人员评估了PVA-CD40在体外对树突状细胞激活的影响。从C57BL/6小鼠骨髓中分离出相应数量树突状细胞(BMDC)经过PVA-CD40处理24 h，蛋白印迹分析显示，PVA-CD40诱导BMDCs通过增加P65和ERK-1/2的磷酸化来激活NF-κB信号通路。此外，与PVA-CD40孵卵后可诱导DC上的共刺激信号分子上调。以上结果说明，PVA-CD40多价超分子网络结构的形成是激发免疫刺激诱导DCs有效激活的关键。
为了进一步评价PVA-CD40对DC的激活作用，研究人员通过流式细胞术检测共刺激分子CD80和CD86的表达。结果显示PVA-CD40的CD80和CD86的表达量比CD40L增加了1.4倍。此外，白细胞介素(IL)- 12p70和肿瘤坏死因子α (TNF-α)的分泌显著增加。以上结果表明PVA-CD40具有较好的刺激DC细胞成熟的效果。PVACD40较好的激活效果可能是由于其快速形成的超分子网络结构，能够诱导CD40受体大规模寡聚化，达到最佳的激活效果。 
图5 PVA-CD40诱导CD40受体寡聚化 于此同时，研究人员通过荧光标记的方式，借助活体荧光成像技术，直接观察了皮下注射的PVA-CD40在小鼠体内的分布情况。研究人员发现，PVA-CD40 能够快速、高效引流到淋巴结，同时与CD40 mAb 相比，在淋巴结内的滞留时间更长。更重要的是，PVA-CD40在活体内也表现出了理想的激活效果。与CD40 mAb 相比，PVA-CD40 能够持续有效的激活淋巴结DCs（图6）。 
图6 PVA-CD40在小鼠体内淋巴结靶向和延长免疫应答 5. 抗肿瘤治疗效果及相关机理
研究人员考察了PVA-CD40潜在的抗肿瘤活性。多项研究，已经证明CD40为靶点的激动剂联合用药下，能够产生更优的治疗效果。因此研究人员首先利用4T1皮下移植瘤模型中，将PVA-CD40和化疗相结合（图7）。结果表明，DOX和PVA-CD40的联合治疗组表现出最有效的肿瘤抑制，并延长小鼠生存。此外，经联合化疗组治疗后的肿瘤组织，具有更多的CD8+ T细胞浸润，表明阿霉素（DOX）等化疗药物的联合可诱导肿瘤免疫原性死亡，产生肿瘤抗原被DC吞噬和处理，然后被转运到淋巴结以激活T细胞。此时PVA-CD40能够显著上调DC细胞共刺激分子CD80和CD86的表达，继而促进了T细胞特异的抗肿瘤免疫反应。同时，研究者们也通过移除原发肿瘤，接种到对侧的转移瘤模拟模型，来验证PVA-CD40是否诱导持续的抗肿瘤免疫反应。结果表明，经PVA-CD40免疫诱导后，联合化疗仍然能显著抑制肿瘤生长。
免疫检查点抑制通过维持先前已建立的抗肿瘤免疫活性。而CD40作为刺激性免疫治疗靶点，主要集中在免疫反应的早期阶段，间接地激活T细胞。二者的联合能不同“时空”互补，发挥联合抗肿瘤免疫效果。研究者利用4T1皮下移植瘤模型，评估PVA-CD40联合PD-1抗体的抗肿瘤免疫效果。结果表明，通过PVA-CD40的预先免疫调节，抗PD-1的治疗效果得到明显提高。流式结果提示在给予PVA-CD40后，小鼠肿瘤具有更多的CD8+T细胞，更低的Treg细胞比例。这表明PVA-CD40在改善肿瘤免疫微环境中的具有很大的潜力（图8）。能够辅助肿瘤特异性T细胞反应的启动，进一步增加T细胞浸润。从而发挥增强的抗肿瘤免疫。
此外，为了评估PVA-CD40是否能诱导广泛而有效的免疫反应，研究者在高度侵袭性B16F10黑色素瘤模型中验证了其可行性。观察到同样可观的肿瘤抑制效果。同时研究者还利用尾静脉注射肿瘤细胞的方式，构建肿瘤远处转移模型，证明了PVA-CD40 在抑制肿瘤转移方面也表现出良好的效果。（图9）  
图7 PVA-CD40联合化疗可抑制局部和远处肿瘤的生长
 
图8 ，PVA-CD40联合PD-1抗体在4T1皮下移植瘤模型的抗肿瘤效果 
图9 PVA-CD40联合PD-1抗体在B16F10黑色素瘤模型中展现出优异的抗肿瘤生长和和转移。 

小结

研究人员发展了新型的CD40特异性多价肽激动剂，表现出高效、持续的免疫应答，避免了脱靶效应导致的副作用。特点如下：
① 低分子量肽激动剂能够在淋巴结内有效富集，与CD40靶蛋白特异性结合改变多肽构象，加速多肽分子与CD40受体形成多聚体结构。② 独特的多聚体的多价设计，克服了传统抗体药物和小分子药物脱靶效应导致的免疫副作用。③ 自适应性的多价强键合，导致多肽/CD40形成稳定的多聚体，激活下游信号转导，体内诱导持久的免疫应答。④ 结合化疗或抗PD -1治疗，在多种肿瘤模型中取得的优异的抗肿瘤效果
总之，PVA-CD40的成功构建及其在免疫激活中的乐观效果，证实了自组装多肽可以成为理想的受体寡聚化分子机器，也为后续多功能药物的设计提供了宝贵经验。未来，通过多肽自组装有望在更广阔的时空维度上精确调控生物分子的动态变化，实现安全高效的疾病诊疗。 原文链接Mamuti, M.,^# Wang, Y.,^# Dan Zhao, Y.,^# Wang, J.-Q.,^# Wang, J., Fan, Y.-L., Xiao, W.-Y., Hou, D.-Y., Yang, J., Zheng, R., An, H.-W.* and Wang, H.* (2022), Polyvalent Peptide CD40 Nano-agonist for Targeted Modulation of Dendritic Cells and Amplified Cancer Immunotherapy. Adv. Mater.. Accepted Author Manuscript 2109432.https://doi.org/10.1002/adma.202109432

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