中科院青岛能源所丛志奇研究员 Angew：工程化P450酶实现不饱和烃直接硝化

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摘要

2023年1月20日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所丛志奇研究组在化学化工领域国际顶级期刊《Angewandte chemie International Edition 》上发表了题为“Engineering Cytochrome P450BM3 Enzymes for Direct Nitration of Unsaturated Hydrocarbons”的研究论文。该研究报道了一种机制引导的蛋白质工程方法来增强P450BM3的过氧化物酶功能，首次实现使用亚硝酸盐作为硝化剂，构建工程化P450酶催化不饱和烃直接硝化。 

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内容

硝基化合物作为一种高附加值的化工中间体，在医药、农药、炸药等领域均有广泛应用。目前，工业硝化方法主要采用以硝酸、硫酸“混酸”的方式，具有产物区域选择性差，环境污染严重以及反应条件苛刻等多种缺陷。因此，开发新型生物硝化酶来解决目前工业硝化存在的严重问题具有重要意义。

在前期研究中，研究人员利用酶化学机制指导的蛋白质工程策略成功开发出双功能小分子协同P450催化的过氧化物酶（peroxidase）新功能（ACS Catal. 2021, 11, 8449-8455.），拓展了P450酶的化学应用空间，为开发碳-氢键氧化官能化提供了新策略。研究人员在上述工作基础上，结合酶工程技术将P450过氧化物酶功能应用到不饱和烃的直接硝化上，研究人员首先尝试加入亚硝酸钠作为硝化剂，实现愈创木酚的硝化，通过改变其氧化还原敏感残基，提高其硝化活性，但是反应中仍然有大量羟化产物生成。

研究人员通过在过氧化反应中起关键作用的氨基酸位点引入空间位阻效应，阻止底物靠近活性中心发生过加氧反应，而强化其过氧化物酶功能，催化苯酚的硝化，结果显示其硝化活性得到显著提高，硝化产物比例由2%提高到100%。通过叠加活性口袋关键位点突变，获得了催化苯酚硝化的最优三突变体。以愈创木酚和苯酚的优势突变体构建小型突变体库，拓展底物范围，实现高效催化19个芳香化合物硝化，其中4-氟苯酚的硝化活性最高，其半制备反应的分离产率达到49%。

迄今为止，末端芳香烯烃化合物的直接硝化仍未见报道，研究人员利用已构建的人工P450硝化酶成功催化苯乙烯的直接硝化。拓展底物范围，实现9个取代苯乙烯类化合物的直接硝化，结果表明带富电子基团的苯乙烯衍生物硝化活性比卤代苯乙烯高。这一研究获得了迄今为止催化效率最高、底物范围最广的人工P450硝化酶。最后，研究人员通过晶体学研究以及自由基捕获和控制实验揭示了直接硝化反应机理。

这一研究成果不但为生物催化硝化开辟了新的途径，而且为促进P450工程酶的过氧化物酶功能在合成化学和合成生物学领域的应用提供了新思路。

相关工作近日已在线发表于国际权威期刊Angew. Chem. Int. Ed.《德国应用化学》。青岛能源所王曦翎博士、林晓丹硕士、姜谊平博士、秦相全为论文共同第一作者，青岛能源所丛志奇研究员为通讯作者。本研究得到山东省自然科学基金、国家自然科学基金、国家重点研发计划等的大力支持。

原文链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202217678

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